זיהוי של RNAs מעגלית באמצעות רצפי RNA
Summary
RNAs מעגלית (circRNAs) הם RNAs שאינם מצפינה לקידוד שעשויים להיות בעלי תפקידים ברגולציה ובניהול אינטראקציות מדיה בין חלבונים. בעקבות הערכה של פרמטרים שונים לבניית ספריות רצף circRNA, פרוטוקול הושלם באמצעות הכנה נטוש הכולל הספריה RNA עם RNase R טרום טיפול והוא מוצג כאן.
Abstract
RNAs מעגלית (circRNAs) הם מחלקה של RNAs שאינם קידוד מעורב פונקציות כולל מיקרו-RNA (miRNA) רגולציה, גישור של אינטראקציות חלבונים חלבון, ויסות של תמלול הורים. ברצף הקלאסי של RNA הדור הבא (RNA-seq), circRNAs הם בדרך כלל להתעלם כתוצאה מבחירה פולי-A במהלך הבנייה של ספריות mRNA, או מצויים בשפע נמוך מאוד, ולכן קשה לבודד ולזהות. כאן, פרוטוקול בנייה של ספריית circRNA היה מיטבי על ידי השוואת ערכות הכנה לספריות, אפשרויות טרום טיפול וכמויות שונות של קלט RNA. שני מסחרית זמין שלמים הכנה הספרייה ערכות, עם ובלי RNase R טרום טיפול, ושימוש כמויות משתנה של סך RNA קלט (1 כדי 4 μg), נבדקו. לבסוף, מספר סוגי רקמות; כולל כבד, ריאות, לימפה הלימפה, ולבלב; כמו גם אזורי מוח מרובים; כולל המוח העליון, האונה הקודקודית, פיתול הרקה התיכונה, קליפת העורף, והפיתול הקדמי העליון; הושוו להערכת השפע circRNA על פני סוגי רקמות. ניתוח של נתוני ה-RNA-seq שנוצרו באמצעות שישה כלי איתור מסוגים שונים של כלים (find_circ, CIRI, מפות, סכין, DCC ו-Circrna) חשף שערכת הכנה של ספריית RNA הכוללת את הספריה עם RNase R ו-4 μg כניסת RNA היא המיטבית שיטה לזיהוי המספר הקרוב ביותר של circRNAs. בהתאם לממצאים הקודמים, ההעשרה הגבוהה ביותר של circRNAs נצפתה ברקמות המוח לעומת סוגי רקמות אחרים.
Introduction
Rnas מעגלית (circrnas) הם אנדוגני, rnas שאינם קידוד שקיבלו תשומת לב באמצעות הביטוי המתפשט שלהם ב-איקריוטית הטרנססקריפט1,2,3. הם נוצרו כאשר exons בחזרה אחד לשני ולכן נחשבו בתחילה להיות החדרת חפצים4,5. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו כי סוג תא מוצג, רקמה, התפתחות ביטוי ספציפי בשלב3,6 והוא שימור אבולוציונית2,3. יתר על כן, הם מעורבים בגישור של חלבון-חלבון אינטראקציות7, מיקרו RNA (mirna) כריכה3,8,9,10, ויסות של שעתוק גן הורים11.
ברצף RNA הקלאסי (RNA-seq), circRNAs עשוי להיות אבוד לחלוטין במהלך בניית הספרייה כתוצאה פולי בחירה של mRNAs או עלול להיות קשה לבודד נתון שלהם שגשוג נמוך. עם זאת, לימודי האפיון האחרונים שילבו צעד טרום טיפול באמצעות rnase R על מנת להעשיר עבור circrna2,12,13. RNase R הוא exoribonuclease כי מעכל RNAs ליניארי, השארת מאחורי מבנים RNA מעגלי. הפרוטוקולים העשרה CircRNA היו ממוטבים על ידי יצירת והשוואת נתונים משני מסחרית זמין שלמות הספרייה ערכות הבנייה, עם וללא צעד RNase R טרום הטיפול, ושימוש בכמויות משתנות של סך RNA קלט (1 עד 4 μg). הפרוטוקול הממוטב נעשה בשלב הבא כדי להעריך את השפע של circrnas על פני חמישה אזורי מוח שונים (המוח השני [BC], האונה הקודקודית [IP], פיתול כישור הזמני האמצעי [MG], קליפת העורף [OC] והפיתול הקדמי העליון [SF]) וארבעה סוגי רקמות אחרים (כבד [LV], ריאה [LU], הלימפה [LN] ו הלבלב [הרשות]). הספריות השונות של RNA מזווגים ברצף והנתונים נותחו באמצעות שישה אלגוריתמים שונים של חיזוי מעגלי: find_circ3, ciri14, מפות15, סכין16, DCC17, ו-circrna18. בהתבסס על האנליזה שלנו, המספר הגבוה ביותר של circRNAs הייחודי זוהה בעת שימוש בערכת הכנה כוללת של הספרייה RNA הכולל עם RNase R טרום הטיפול ו 4 μg כולל הקלט RNA. הפרוטוקול הממוטב מתואר כאן. כפי שדווחו בעבר19,20, העשרת הגבוהים ביותר של circrnas נצפתה במוח לעומת סוגי רקמות אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, שתי ערכות הכנה לספריות זמינות מסחרית, אפשרויות טרום טיפול, וכמויות קלט RNA נבדקו כדי למטב פרוטוקול העשרה של circRNA לבניית ספריות ברצף של circRNA. בהתבסס על הערכות של מחקר זה, מספר היבטים מרכזיים ושלבים קריטיים ביצירת ספריות רצף של circRNA גלויים לעין. ההערכה שלנו מאשרת את השירות של RNase R טרום ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה על באנר שמש המחקר המכון לחקר המוח והגוף תרומות (BBDP) של סאן סיטי, אריזונה לאספקת רקמות המוח האנושי. BBDP נתמך על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (U24 NS072026 המוח הלאומי משאב רקמות למחלת פרקינסון והפרעות קשורות), המכון הלאומי על הזדקנות (P30AG19610 אריזונה מחלת ליבה של אלצהיימר), מחלקת אריזונה של שירותי בריאות (חוזה 211002, אריזונה אלצהיימר מרכז המחקר), הנציבות אריזונה מחקר ביו (חוזים 4001, 0011, 05-901 ו 1001 הקונסורציום מחלת פרקינסון אריזונה) ואת מייקל J. קרן פוקס לחקר פרקינסון27. מחקר זה היה נתמך גם על ידי המולדת ומדינת אריזונה (המענק ADHS ADHS14-052688). אנו מודים גם לאנדריאה שמיט (מחקר באנר) ולסינתיה לצ (TGen) לתמיכה ניהולית.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al. Scrambled exons. Cell. 64 (3), 607-613 (1991).
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
