자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성
Summary
본 호는 시험관 내 및 생체 내에서 사용하기 위해 많은 수의 기능성 T 세포를 산출하는 것을 목표로 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성및 시험관 내 확장에 대한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
타입-1 당뇨병 (T1D)는 베타 세포 파괴 및 인슐린 생산의 절대 손실로 이끌어 내는 아일레 특정 자기 면역에 의해 특징입니다. 자발적인 비비만 당뇨병(NOD) 마우스 모델에서, 인슐린은 1차 표적이며, 이들 동물의 유전자 조작은 단일 키 인슐린 에피토프를 제거하여 질병을 예방한다. 따라서, 이러한 병원성 에피토프를 베어링하는 전문 항원 제시 세포(APC)의 선택적 제거는 원치 않는 인슐린 특이적 자가면역 반응을 억제하는 접근법이며, 가능성이 더 큰 번역 잠재력을 갖는다.
키메라 항원 수용체 (CA)는 선택적으로 질병을 일으키는 항원을 표적으로 하는 T 세포를 리디렉션할 수 있습니다. 이 기술은 다중 암을 취급하기 위하여 입양 세포 치료를 위한 세포 공학을 사용하는 최근 시도에 근본적입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 낮은 수의 순진한 세포로부터 시작하여 기능성 항원 특이적 CD8 CAR-T 세포의 높은 숫자를 생성하는 최적화된 T 세포 레트로바이러스(RV) 형질 전환 및 시험관 내 확장 프로토콜을 설명합니다. 이전에 는 다중 CAR-T 세포 프로토콜이 기술되었지만, 전형적으로 는 상대적으로 낮은 전송 효율 및 세포 생존능후의 트랜스덕션을 가지고 있다. 대조적으로, 우리의 프로토콜은 최대 90%의 환전 효율을 제공하며, 생성된 세포는 생체 내에서 2주 이상 생존하고 단일 주입 후 질병 발병을 현저히 지연시킬 수 있습니다. 당사는 중요한 단계를 쉽게 따를 수 있도록 셀 유지 관리 및 트랜스덕션 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 1차 세포 격리로부터 CAR 발현에 이르는 전체 절차는 14일 이내에 수행될 수 있다. 일반적인 방법은 표적이 공지된 임의의 마우스 질환 모델에 적용될 수 있다. 유사하게, 특정 적용 (병원성 펩티드/MHC 클래스 II 복합체를 표적으로 하는)은 주요 복합체가 확인된 임의의 다른 자가면역 질환 모델에 적용 가능하다.
Introduction
원치 않는 오프 타겟 효과의 가능성이 감소 된 위험을 감안할 때, 항원 특정 면역 치료 (ASI)는 T1D와 같은 자가 면역 질환에 대한 유망한 치료법입니다. 축적 된 증거는 (prepro) 인슐린에 대한 면역 반응이 T1D1에서특히 중요 할 수 있음을 시사합니다. 지난 10 년 동안, 우리 자신을 포함한 여러 그룹의 연구는 특정 MHC 클래스 II 분자 (B : 9-23 / MHCII)에 의해 인슐린 B 사슬 아미노산9 ~23을 함유하는 에피토프의 프리젠 테이션이 T1D의 개발에 중요한 역할을한다는 것을 강력하게 제안합니다. 마우스와인간 2,3,4,5. B:9-23/MHCII 복합체를 선택적으로 표적화하기 위해, 우리는 다른 펩티드를 함유하는 호르몬 인슐린 또는 복합체에 교차 반응성을 가지지 않는 mAb287이라는 단일클론 항체를 생성하였다6. MAb287 블록 항원 프리젠테이션 시험관에서, 및 전 당뇨병 NOD 마우스에 대한 mAb287의 주간 투여는 처리된마우스6의35%에서 T1D의 발달을 지연시켰다. 생체 내에서 항원 프리젠 테이션을 차단하기 위해, 빈번한 주사는 일반적으로 높은 순환 농도를 유지하기 위해 요구된다. 우리는 T 세포를 재프로그래밍하기 위해 Ab287의 높은 특이성을 활용하여 이러한 어려움을 극복할 수 있다고 가설을 세우고 T1D7에 대한 개선된 항원 특이적 T 세포 요법을 제공하였다.
세포독성 T 세포는 그들의 동종 리간드의 단일 사본조차도 8,9,10으로발현되는 경우에도 그들의 표적을 죽일 수 있는 것으로 보고된다. 따라서, B:9-23/MHCII 특이적 CD8 T 세포는 모항체보다 원치 않는 항원 프리젠테이션을 제거하는 데 있어 더 높은 효율을 가질 것으로 예상되며, 이는 그 효과를 발휘하기 위해 동일한 APC상에 여러 복합체에 결합할 필요가 있을 것이다. CAR T 세포는 다중 인간암(11,12,13)치료에 사용되어 왔으며, 또한 자가면역(14)에서 효과적일 수 있다. 그러나, 병원성 펩티드-MHC 복합체에 대한 특이성을 가진 CAR-T 세포는 지금까지 T1D의 진행을 수정하는 데 사용되지 않았다. 아래에 설명된 최적화된 CD8 T 세포 전착 기술을 사용하여, 우리는 최근에 이것이실제로 실행 가능한 접근법 7을 나타낸다는 원리의 증거를 입증했다.
이 프로토콜에서는 효율적이고 능률적인 변환 및 확장 방법을 간략하게 설명합니다. 당사의 프로토콜은 고효율의 마우스 CD8 CAR T 세포의 생성을 요구하는 다른 연구에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 레트로바이러스 성전환에 의해 항원 특이적 CD8 CAR-T 세포를 제조하기 위한 효율적인 방법을 설명한다. 당사의 프로토콜의 전형적 감전 효율은 전형적으로 높으며, CAR의 강력한 발현이 일반적으로 관찰된다. 확장된 CAR T 세포는 부모 활성화 된 T 세포 및 항체 특이성의 필수 특징을 유지하고, 생체 외 및 생체 내 사용 모두에 적합하다. 우리는 NOD 마우스7에 있는 타입-1 당뇨병을 재프?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 JDRF 교부금 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, SRA-2-S-2018-648-S-B, 당뇨병 교육 및 행동 상, 그리고 베일러 의학 대학에서 분자 의학 연구를 위한 캐롤라인 비스 법률 기금에 의해 지원되었습니다. 세포 분류는 NIH (S10RR024574 및 P30CA125123)의 자금으로 베일러 의과 대학의 세포 분석 및 세포 선별 코어에 의해 지원되었습니다. 모든 펩티드-MHC 테트라머는 NIH 테트라머 코어 시설에서 수득하였다.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
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