타우는 세포질과 미세관을 결합하는 핵에 모두 존재하는 신경 단백질로 알츠하이머 병 관련 유전자의 변조를 포함한 틀에 얽매이지 않는 기능을 발휘합니다. 여기서, 우리는 세포질 타우에서 오는 간섭을 배제하면서 핵타우의 기능을 조사하는 방법을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
타우는 뉴런에서 발현되는 미세소관 결합 단백질이며, 그 주요 알려진 기능은 세포골격 안정성의 유지와 관련이 있다. 그러나, 최근의 증거는 타우가 DNA 보호, rRNA 전사, 레트로 트랜스포손의 이동성 및 구조 적 조직에 연루된 핵을 포함한 다른 세포 외 구획에도 존재한다는 것을 나타냈다. 핵균. 우리는 최근에 핵 타우가 VGluT1 유전자의 발현에 관여한다는 것을 보여주었습니다, 알츠하이머 병의 초기 단계에서 조미료 방출의 병리학적 증가를 설명할 수 있는 분자 기계장치를 건의하. 최근까지, 표적 유전자의 발현을 조절하는 핵타우의 개입은 세포질 타우의 기여의 배제 또는 다른 그 효과의 배제를 방지하는 기술적 한계로 인해 상대적으로 불확실하고 모호하게 되어 왔다. 핵 타우와 관련이없는 다운 스트림 요인. 이러한 불확실성을 극복하기 위해, 우리는 핵타우 단백질에 의해 특이적인 변조된 표적 유전자의 발현을 연구하는 방법을 개발하였다. 우리는 세포화 신호와 세포분열의 사용을 결합하는 프로토콜을 채택하여 세포질 타우 분자로부터의 간섭을 배제할 수 있게 했습니다. 가장 주목할 만한, 프로토콜은 쉽고 다른 세포 유형 및 세포 조건에서 Tau의 핵 기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용 가능한 고전적이고 신뢰할 수있는 방법으로 구성됩니다.
서론
핵에서 타우 단백질의 기능은 핵산1,2,3,4,5,6과밀접하게 연관되어 있는 것으로 나타났기 때문에 최근 몇 년 동안 상당한 관심을 얻고 있다. 실제로, 최근 게놈 전체 연구는 타우가 생체 내에서 genic 및 intergenic DNA 서열을 결합한다는 것을 보여주었습니다7. 뉴클레올라 조직에서의 역할은8,9,10,11로제안되었다. 더욱이, 타우는 산화 및 고열 스트레스5,10,12,
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프로토콜
1. 세포 배양
- 배양 SH-SY5Y 세포(인간 신경아세포종 세포주, CRL-2266) 완전한 배지(덜베코의 변형된 이글 배지:영양 혼합물 F12 [DMEM/F-12]를 10% 태아 소 혈청[FBS], 2 mML-글루타민, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충하였다. 37 °C 및 5 %CO2에서인큐베이터에서 세포를 유지합니다. 10cm 접시에 세포를 성장하고 수렴 할 때 분할.
2. 세포 분화
- SH-SY5Y 세포를 분화하기 위해 도금 다음날, 10 μM 레티노산(RA)을 첨가하여 5일 동안 배지를 완성합니다.
- 6일째는 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM/F-12를 분화 배지로 대체합니다. FBS 나 항생제를 추가하지 마십시오.
- 세포를 분화 배지에서 3일 동안 성장시다.
3. 키메라 구조물 복제
- 타우서열 0N4R(383aa)의 3' 말단에서 프레임에 제한 효소 소화에 의해 복제하여 타우-NLS 구성을 생성하여 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA....
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결과
세포질 타우 단백질의 기여를 피하는 유전자 발현에서 핵타우의 영향을 해부하는 데 사용되는 전략은 도 1에도시되어 있다. 간단히, NLS 또는 NES로 태그된 타우 단백질은 각각 핵 구획에서 축적되거나 배제된다. 이러한 불균형의 기능적 효과는 VGluT1 유전자의 생성물로 측정된 유전자 발현의 변화이다.
프로토콜 설명에 따라, SH-SY5Y 세포를 MIToTIC 후 신경유사 세포를 얻기 위해 5일 동안 RA로 처리한 다음 BDNF로 3일 동안 처리하였다(도2). RA 및 BDNF의 부재에서, 미분화 된 SH-SY5Y 세포는 둥근 형태를 가정하고 세포 덩어리를 형성한다. 예상대로, 분화 프로토콜을 시작, 덩어리가 풀고 세포는 신경구를 확산; 분화의 끝에서, 세포.......
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토론
우리는 유전자 발현에 핵 타우 단백질의 영향을 측정하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜을 사용하면 세포질 타우의 기여가 강력하게 제한됩니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다: 인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포의 분화, 핵 구획에서 타우 단백질의 세포 분열 및 국소화.
먼저, 대표적인 결과 섹션에 나타난 바와 같이, RA 및 BDNF를 첨가하여 SH-SY5Y 세포의 분화는 배양에서 뉴런 유사 세포의 양호한 제제를 얻는 데 매우 중요하다. 더 낮은 조밀도가 세포 증식에 영향을 미칠 수 있기 때문에 종자 된 세포의 밀도는 특히 중요합니다. 더욱이, 세포 분획 및 웨스턴 블롯과 같은 많은 수의 세포를 필요로 하는 실험의 경우, BDNF 분화 단계는 말단 분화를 허용하도록 세포 증식을 차단하여 배양내의 세포 수를 제한한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 대체 분화 프로토콜은 BDNF 대신 RA 또는 NGF만 사용합니다. 그러나, RA 후 BDNF를 첨가하면 더 나은 형태학.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 스쿠올라 노멀 슈페리어 (SNS14_B_DIPRIMIO 의 보조금에 의해 지원되었다; SNS16_B_DIPRIMIO).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 633 염소 안티 마우스 IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| 안티 액틴 항체 | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | 안티 토끼 WB 1:10,000 |
| 안티 GAPDH 항체 | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | 안티 마우스 WB 1:10,000 |
| 안티 H2B 항체 | Abcam | ab1790 | 안티 토끼 WB 1:15,000 |
| 안티 Tau-13 항체 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | 안티 마우스 WB 1:1,000; IF 1:500 |
| 안티 튜불린 알파 항체 | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | 안티 마우스 WB 1:5,000 |
| 안티 VGluT1 항체 | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | 안티 마우스 WB 1:500 |
| BCA 단백질 분석 키트 | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| 블로팅 등급 차단제 | Biorad | 1706404 | 무지방 분유 |
| 보빈 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | 프로테아제 억제제 |
| Criterion TGX 4-20% 무스테인, 10 | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle의 중간 저당 | 유로 클론 | ECM0060L | |
| EDTA | 시그마 - 알드리치 | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| 태아 혈청 | 유로 클론 | EC50182L | |
| 글리세롤 | 시그마 - 알드리치 | G5516-500ml | |
| 염소 안티 마우스 IgG - HPR | 산타 크루즈 생명 공학 | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| 염소 안티 토끼 IgG - HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass | slide nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 형질주입 시약 | , Thermo Fisher Scientific | 12566014 양이온성 지질 | |
| 메탄올 | , Sigma-Aldrich | , 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, | S3014-1kg | |
| , Opti-MEM, 저혈청, 배지 | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| 인산염 완충 식염수(Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| 배양 세포용 레티노산 | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| 세포 이하 단백질 분획 키트 | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| 지원 니트로셀룰로오스 멤브레인 | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 비이온 계면활성제 |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 매체 | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA 정제 시스템 | 프로메가 | A1330 | 3.5 |
참고문헌
- Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
- Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain.....
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