دراسة ديناميات التصاق الخلوي وانتشار الخلايا الظهاريه علي الفيبرونكتين اثناء الاكسده
Summary
هذا الأسلوب مفيد لتحديد الديناميكيات المبكرة للتصاق الخلوية وانتشار الخلايا التي تعتمد علي المرسي علي الفيبرونكتين. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام هذا الفحص للتحقيق في اثار تغيير الاكسده والاختزال علي الخلية المنتشرة و/أو الخلايا المرتبطة بالتصاق الخلية مسارات الإشارات داخل الخلايا.
Abstract
التصاق وانتشار الخلايا علي مصفوفة خارج الخلية (ECM) هي العمليات الخلوية الاساسيه خلال التنمية الاسطحه والتوازن للانسجه الكبار. ومن المثير للاهتمام, الاكسده يمكن ان يغير هذه العمليات, التالي المساهمة في الفيزيولوجيا المرضية للامراض مثل السرطان المنتشر. ولذلك ، فهم اليه (ق) من كيفيه إرفاق الخلايا وانتشارها علي ECM خلال الاضطرابات في حاله الاكسده والاختزال يمكن ان توفر نظره ثاقبه في الدول العادية والامراض. وصفها أدناه هو بروتوكول خطوه الحكيمة التي تستخدم الفحص القائم علي المناعي لتحديد كميه التصاق الخلية ونشر الخلايا الليفية خلدت علي الفيبرونكتين (FN) في المختبر. لفتره وجيزة ، يتم عقد الخلايا التي تعتمد علي المرسي في التعليق وتتعرض لمثبطات الصراف الألى كيناز Ku55933 للحث علي الاكسده. ثم يتم طلاء الخلايا علي سطح مطلي بالFN ويسمح لها بالإرفاق لفترات زمنيه محدده مسبقا. والخلايا التي تبقي مرفقه ثابته وموسومة بعلامات الأجسام المضادة المستندة إلى الفلورية للتصاق (مثلا ، باكيلين) والانتشار (مثلا ، F-actin). ويجري الحصول علي البيانات وتحليلها باستخدام معدات مختبريه متاحه عاده ، بما في ذلك المجهر الكتابي وبرمجيات فيجي المتاحة بحريه. هذا الاجراء هو تنوعا للغاية ويمكن تعديلها لمجموعه متنوعة من خطوط الخلايا, البروتينات ECM, أو مثبطات من أجل دراسة مجموعه واسعه من المسائل البيولوجية.
Introduction
التصاقات مصفوفة الخلية (اي التصاقات البؤرية) هي مركبات البروتين الجزيئية الكبيرة والديناميكية التي تتوسط التصاق الخلايا وتنتشر. هذه العمليات هي حاسمه لتطوير الانسجه ، والصيانة ، والوظائف الفسيولوجية. وتتالف التصاقات البؤرية من مستقبلات مرتبطة بالغشاء ، مثل التكاملات ، فضلا عن البروتينات السقالات التي تربط الخلايا الدهنية الخلوية بالمصفوفة الخارجة عن الخلية (ECM)1. هذه المجمعات قادره علي الاستجابة للإشارات الفيزيائية الموجودة في البيئة خارج الخلية من خلال تفعيل مختلف الإشارات محولات المسارات. علي هذا النحو ، التصاقات البؤرية بمثابه مراكز الإشارات لنشر العظة الميكانيكية خارج الخلية في عدد من العمليات الخلوية بما في ذلك الهجرة الموجهة ، وتنظيم دوره الخلية ، والتمايز ، والبقاء علي قيد الحياة1،2. مجموعه واحده من الجزيئات الإشارات التي تنظم وتتفاعل مع التصاقات البؤرية تشمل أعضاء عائله رو من GTPases الصغيرة. رو GTPases هي البروتينات الرئيسية التي تنظم هجره الخلايا وديناميات التصاق من خلال التنشيط المكاني المحدد3. ليس من المستغرب ، وقد تورط تقلبات وظيفة البروتين رو في عدد من الامراض البشرية مثل الانبثاث ، وتولد الاوعيه ، وغيرها. من المهم بشكل خاص ، حاله الاكسده الخلوية يلعب دورا مهيمنا في تشكيل هجره الخلايا والتصاق. التعديلات في التوازن الاكسده ، مثل الزيادات في أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وقد ثبت لتنظيم النشاط رو البروتين ، فضلا عن التصاق ، في عدد من أنواع الخلايا والامراض البشرية4،5،6 و7و8. علي سبيل المثال ، الافراد الذين يعانون من الاضطراب العصبي ترنح-توسع الشعيرات (ا-T) ، والذي يسببه طفرة في إصلاح الضرر الحمض النووي سيرين/threonine كيناز A-T-تحور (ATM) ، لديها زيادة خطر الاصابه بالسرطان المنتشر9، 10-الآن فقدان النشاط الصراف الألى كيناز في هذه المرضي وخطوط الخلايا ، اما من خلال الطفرة الجينية أو تثبيط الكيميائية ، والنتائج في مستويات عاليه من الاكسده بسبب الخلل في المسار الفوسفات البنتوز7،11، 12-الآن وعلاوة علي ذلك ، سلطت الدراسات الاخيره من المختبر الضوء علي دور الفيزيولوجيا المرضية لروس في a-T عن طريق تغيير ديناميات خلوي (اي التصاق والانتشار) كنتيجة مباشره لتفعيل جي تي اس الاسره في المختبر5. في نهايةالمطاف ، هذه التعديلات في ديناميات خلوي الناجمة عن تنشيط الاسره رو قد يؤدي إلى زيادة خطر الاصابه بالسرطان المنتشر لاحظت في المرضي-T5،13. لذلك ، فهم التفاعل بين التفاعلات مصفوفة الخلية اثناء الاكسده يمكن ان توفر رؤى في تنظيم التصاق والانتشار. ويمكن لهذه الدراسات أيضا ان تمهد السبيل لمزيد من التحقيقات في دور محتمل لل GTPases الاسره رو في هذه العمليات الإشارات.
وصف هنا هو بروتوكول لدراسة ديناميات الخلوية في وقت مبكر من تجميع التصاق والانتشار اثناء الاكسده الناجمة عن تثبيط نشاط الصراف الألى كيناز. ويستند هذا الفحص علي اليه المميزة للتصاق الخلايا المعتمدة علي المرسي بالبروتين الفيبرونكتين (FN). عندما يتم طلاء الخلايا المحتفظ بها في نظام التعليق علي FN ، عده رو gtpases تنسيق السيطرة علي سيتوسيكيلتال أعاده عرض3،14. وتلاحظ التغييرات المورفولوجية كما تحول الخلايا من الجولة والتعميم في المظهر إلى الأرض وتوسيعها. بالتزامن مع هذه الملاحظات هو تطوير العديد من التصاقات مصفوفة مع ECM. نسبت هذا تغيرات إلى ال [بيهاسيك] تنشيط من [روا] مع Rac1 اثناء الساعة اولي بما ان خلايا يلتصق وينشر 15,16.
وقد استخدمت مجموعه متنوعة من الطرق لفحص الشكل والديناميكيات التصاق وكذلك انتشار الخلايا. ومع ذلك ، تعتمد هذه الطرق علي متطورة طويلة الأجل ، والتصوير الحي الكلي الانعكاس الداخلي الفلوري (TIRF) أو نظم المجهر البؤري. التالي ، يجب ان يحصل المستخدمون علي معدات وبرامج متخصصة. وعلاوة علي ذلك ، فان وقت الاعداد الذي تتطلبه أنظمه التصوير الحيوي هذا يجعل التقاط احداث التصاق المبكر تحديا ، خاصه عند اختبار مثبطات متعددة أو ظروف معالجه متزامنة.
الأساليب المفصلة ، هنا ، توفر طريقه واضحة واقتصاديه ولكن كميه لتقييم المعلمات التي تحكم تجميع التصاق والانتشار في المختبر. يتم تنفيذ البروتوكول باستخدام المعدات المختبرية المتاحة عاده ، مثل المجهر الكتابي وكاميرا CCD. يتضمن هذا الفحص تطبيق الخلايا المعتمدة علي المرسي علي سطح مطلي بالقوات الخاصة بعد فتره من الاكسده الناجمة عن التثبيط الكيميائي لنشاط الصراف الألى ، والذي تم إثباته في السابق5. بعد الطلاء ، ويسمح للخلايا لنعلق والتزام لفترات محدده من الزمن. يتم غسلها الخلايا غير المرفقة بعيدا ، في حين يتم إصلاح الخلايا المرفقة ووصفت مع الأجسام المضادة القائمة علي الفلورية لعلامات التصاق (علي سبيل المثال ، باكيلين) والانتشار (علي سبيل المثال ، F-actin)2،5. ثم يتم تصور هذه البروتينات وتسجيلها باستخدام المجهر الكتابي. ويجري تحليل البيانات اللاحقة باستخدام برامجيات فيجي المتاحة بحريه. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تكييف هذه الطريقة لفحص ديناميات التصاق تحت مجموعه واسعه من الشروط بما في ذلك البروتينات المختلفة ECM ، والعلاج مع مختلف العوامل المؤكسدة/ثقافة الخلايا أو مجموعه متنوعة من خطوط الخلايا التي تعتمد علي مرسي لمعالجه مجموعه واسعه من المسائل البيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا هو طريقه متعددة واقتصاديه للشاشة بسرعة عدد من أنواع الخلايا التي تعتمد علي المرسي لأعاده عرض ديناميكية خلوي اثناء انتشار الخلية. علي وجه الخصوص ، هذا الأسلوب يفحص كميا ألياف الإجهاد وتشكيل التصاق البؤري اثناء الاكسده عندما تلتصق الخلايا إلى FN (الشكل 1A</st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفان السيد سكوت ر. هوتون وميشان س. بلاكدج علي المراجعة النقدية لهذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل البحوث والبرامج التي ترعاها جامعه هاي بوينت وبرنامج التكنولوجيا الحيوية في جامعه ولاية كارولينا الشمالية.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
- Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
- Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
- Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
- Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
- Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
- Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
- Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
- Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
- Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
- Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
- Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
- Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
- Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
- Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
- Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
- Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
- Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
- Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
- Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
- Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
- Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).
