Summary

Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

Published: October 13, 2019
doi:

Summary

Deze methode is nuttig voor het kwantificeren van de vroege dynamiek van cellulaire adhesie en het verspreiden van verankerings afhankelijke cellen op het fibronectin. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de effecten van veranderde redox homeostase op celspreiding en/of celadhesie-gerelateerde intracellulaire signalering trajecten te onderzoeken.

Abstract

De hechting en verspreiding van cellen op de extracellulaire matrix (ECM) zijn essentiële cellulaire processen tijdens de organismale ontwikkeling en voor de homeostase van volwassen weefsels. Interessant is dat oxidatieve stress deze processen kan veranderen en zo bijdraagt aan de pathofysiologie van ziekten zoals gemetastaseerde kanker. Daarom kan het begrijpen van het mechanisme (s) van hoe cellen hechten en zich verspreiden op de ECM tijdens verstoringen in redox status inzicht geven in de normale en ziektetoestanden. Hieronder beschreven is een stapsgewijs protocol dat een immunofluorescentietest gebruikt om specifiek celadhesie en verspreiding van vereeuwigd fibroblast cellen op fibronectin (FN) in vitro te kwantificeren. Kort, verankerings afhankelijke cellen worden vastgehouden in suspensie en blootgesteld aan de ATM kinase remmer Ku55933 voor het opwekken van oxidatieve stress. Cellen worden vervolgens geplateerd op een FN-gecoat oppervlak en mogen voor vooraf bepaalde perioden worden bevestigd. Cellen die bevestigd blijven, zijn vast en gelabeld met fluorescentie-antilichaam markers van hechting (bijv. paxiline) en verspreiden (bijv. F-actin). Gegevensverzameling en-analyse worden uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, waaronder een epifluorescentie Microscoop en gratis beschikbare Fiji-software. Deze procedure is zeer veelzijdig en kan worden aangepast voor een verscheidenheid aan cellijnen, ECM-eiwitten of remmers om een breed scala aan biologische vragen te onderzoeken.

Introduction

Celmatrix verklevingen (d.w.z. focale verklevingen) zijn grote en dynamische multimoleculaire proteïne-complexen die de hechting en verspreiding van cellen bemedieren. Deze processen zijn essentieel voor weefsel ontwikkeling, onderhoud en fysiologische functie. Focale verklevingen zijn samengesteld uit membraan-gebonden receptoren, zoals integrinen, evenals steigers eiwitten die cytoskelet actine koppelen aan de extracellulaire matrix (ECM)1. Deze complexen zijn in staat om te reageren op fysiochemische signalen die aanwezig zijn in de extracellulaire omgeving door het activeren van verschillende signalering transductie trajecten. Als zodanig, focale adhesies dienen als signalering centra te propageren extracellulaire mechanische aanwijzingen in een aantal cellulaire processen, met inbegrip van gerichte migratie, celcyclus regulering, differentiatie, en overleving1,2. Een groep van signalering moleculen die reguleren en interactie met focale adhesies omvat leden van de familie van de Rho van kleine GTPases. Rho GTPases zijn belangrijke eiwitten die de Celmigratie en adhesie dynamiek reguleren via hun specifieke spatiotemporele activatie3. Niet verrassend, disregulatie van de Rho eiwit functie is betrokken bij een aantal menselijke pathologieën zoals metastase, angiogenese, en anderen. Van bijzonder belang, cellulaire redox status speelt een overheersende rol in de modulatie van de Celmigratie en adhesie. Veranderingen in redox homeostase, zoals stijgingen van de reactieve zuurstof soorten (Ros), zijn aangetoond dat het reguleren van de Rho-eiwit activiteit, evenals adhesie, in een aantal celtypen en menselijke ziekten4,5,6 ,7,8. Bijvoorbeeld, personen die lijden aan de neurologische aandoening ataxie-Telangiectasia (A-T), die wordt veroorzaakt door een mutatie in de DNA-schade herstel serine/Threonine kinase A-T-gemuleerd (ATM), hebben een verhoogd risico op gemetastaseerde kanker9, 10. Verlies van ATM kinase activiteit bij deze patiënten en cellijnen, hetzij door genetische mutatie of chemische remming, resulteert in hoge niveaus van oxidatieve stress als gevolg van disfunctie van de pentose fosfaat pathway7,11, 12. Bovendien hebben recente studies van het laboratorium een pathofysiologische rol voor ROS in A-T belicht door de cytoskelet dynamiek (d.w.z. adhesie en verspreiding) te veranderen als een direct gevolg van het activeren van de Rho familie GTPases in vitro5. Uiteindelijkkunnen deze veranderingen in de cytoskelet dynamiek veroorzaakt door de activering van de familie Rho leiden tot het verhoogde risico van gemetastaseerde kanker bij A-T patiënten5,13. Daarom kan het begrijpen van het samenspel tussen celmatrix interacties tijdens oxidatieve stress inzicht geven in de regulering van adhesie en verspreiding. Deze studies kunnen ook het podium voor verdere onderzoeken naar een mogelijke rol voor Rho familie GTPases in deze signalering processen.

Hierin beschreven is een protocol voor het bestuderen van de vroege cellulaire dynamiek van adhesie assemblage en verspreiding tijdens oxidatieve stress veroorzaakt door remming van ATM kinase activiteit. Deze test is gebaseerd op het goed gekarakteriseerde mechanisme van verankerings afhankelijke cellen adhesie aan het ECM-eiwit fibronectine (FN). Wanneer cellen in suspensie worden geplateerd op FN, coördineren verschillende Rho gtpases de controle van de actine cytoskelet remodellering3,14. Morfologische veranderingen worden waargenomen als cellen verschuiven van ronde en cirkelvormig in uiterlijk tot afgevlakt en uitgevouwen. Gelijktijdig met deze waarnemingen is de ontwikkeling van talrijke matrix verklevingen met de ECM. Deze veranderingen worden toegeschreven aan de bifasische activering van rhoa met Rac1 tijdens het eerste uur als cellen zich hechten en verspreiden 15,16.

Een verscheidenheid van methoden zijn gebruikt voor het onderzoeken van adhesie morfologie en dynamiek, alsmede de verspreiding van cellen. Deze methoden zijn echter gebaseerd op geavanceerde, op lange termijn, Live-Imaging totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) of confocale microscopie systemen. Gebruikers moeten dus toegang hebben tot gespecialiseerde apparatuur en software. Bovendien maakt de set-up tijd die nodig is voor deze bio-imagingsystemen het vastleggen van vroege adhesie gebeurtenissen uitdagend, vooral bij het testen van meerdere remmers of behandelings condities gelijktijdig.

De hier beschreven methoden bieden een eenvoudige, economische en toch kwantitatieve manier om parameters te beoordelen die de adhesie-assemblage beheersen en in vitro verspreiden. Het protocol wordt uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, zoals een epifluorescentie-Microscoop en een CCD-camera. Deze bepaling omvat het toepassen van verankerings afhankelijke cellen op een oppervlak met FN-coating na een periode van oxidatieve stress veroorzaakt door chemische remming van ATM kinase activiteit, die eerder is aangetoond5. Na het bekleden zijn cellen toegestaan om te hechten en zich te hechten voor gespecificeerde lengtes van tijd. Niet-bevestigde cellen worden weggespoeld, terwijl de bijgevoegde cellen zijn bevestigd en geëtiketteerd met fluorescentie-antilichamen tegen markers van hechting (bijv. paxiline) en verspreiden (bijv. F-actin)2,5. Deze eiwitten worden vervolgens gevisualiseerd en opgenomen met behulp van een epifluorescentie Microscoop. Daaropvolgende data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van gratis beschikbare Fiji-software. Bovendien kan deze methode worden aangepast om de adhesie dynamiek onder een breed scala aan omstandigheden te onderzoeken, waaronder verschillende ECM-eiwitten, behandeling met verschillende oxidanten/celkweek omstandigheden of een verscheidenheid aan verankerings afhankelijke cellijnen om een breed scala aan biologische vragen.

Protocol

1. preparaten Opmerking: het hieronder beschreven protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met REF52 cellen en ATM+/+ of ATM-/- menselijke fibroblasten. Voor andere celtypen is mogelijk verdere optimalisatie vereist, zoals beschreven in de sectie opmerkingen en probleemoplossing hieronder. Maak 500 mL volledig celkweekmedium voor REF52 cellen. Tot 500 mL hoge glucose bevattende Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium (DMEM) toevoegen 10% FBS, 2 mM L-glutamine, …

Representative Results

Een algemeen schema van de experimentele opstelling Figuur 1 vertegenwoordigt het algemene schema voor de celadhesie en het verspreidings protocol beginnend met de serum verhongering van REF52 cellen en eindigend met computationele analyse van verworven fluorescentie beelden. De belangrijkste stappen in het protocol worden geïllustreerd in de tijdlijn. Opmerking, stap 2 van het protocol beschrijft de bereiding van de FN-gecoate dekstroken, die gelijktijdig moeten w…

Discussion

Het hier beschreven protocol is een veelzijdige en voordelige manier om snel een aantal verankerings afhankelijke celtypen te schermen voor dynamische cytoskelet-remodellering tijdens het verspreiden van cellen. In het bijzonder onderzoekt deze methode kwantitatief stress vezels en focale adhesie vorming tijdens oxidatieve stress wanneer cellen zich houden aan FN (Figuur 1a). Bovendien kunnen deze cellulaire fenotypes een regelgevende rol suggereren voor leden van de familie Rho van kleine g…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken drs. Scott R. Hutton en Meghan S. Blackledge voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de High Point University Research en gesponsorde programma’s (MCS) en het biotechnologie programma aan de North Carolina State University (MCS).

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x) Gibco by Life Technologies 25300-054 cell dissociation
10 cm2 dishes Cell Treat 229620 sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes Fisher Scientific 05-539-5 sterile
1X Phosphate Buffered Saline Corning Cellgro 21-031-CV PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates Fisher Scientific 07-200-740 sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) BD Transduction Laboratories 610620 marker of focal adhesions
Aspirator Argos EV310
Biosafety cabinet Nuair NU-477-400 Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder Fisher Scientific BP9704-100 dlBSA
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231-100 organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose Fisher Scientific 11965092 REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum Fisher Scientific 16000044 certified, cell culture medium supplement
Fiji National Institutes of Health http://fiji.sc/ image analysis program
Filter syringe Fisher Scientific 6900-2502 0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5) Fisher Scientific 12-545-81 autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum Gibco by Life Technologies 16210-064 component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer Fisher Scientific 22-600-107 for cell counting
Human Plasma Fibronectin Gibco by Life Technologies 33016-015 FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope Olympus microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933 Sigma-Aldrich SML1109-25MG ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera Optimos
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) Invitrogen A12381 marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36941 cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control Corning Incorporated PC-420D
Syringe BD Biosciences 309653 60 mL syringe
Tissue culture incubator Nuair
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution Fisher Scientific 15-250-061 for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x) Gibco by Life Technologies R-002-100 TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator Fisher Scientific 11-676-341
water bath Fisher Scientific FSGPD02

References

  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
  3. Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
  4. Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
  5. Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
  6. Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
  8. Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
  9. Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
  10. Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
  11. Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
  12. Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
  13. Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
  14. Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
  15. Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
  16. Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
  17. Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
  18. Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
  19. Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
  20. Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
  21. Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
  22. Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
  23. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
  24. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  25. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  26. Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
  27. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  28. Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
  29. Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).

Play Video

Cite This Article
Tolbert, C. E., Palmquist, L., Dixon, H. L., Srougi, M. C. Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (152), e59989, doi:10.3791/59989 (2019).

View Video