Esame della dinamica dell'adesione cellulare e della diffusione delle cellule epiteliali su fibronectina durante lo stress ossidativo

Summary

Questo metodo è utile per quantificare la dinamica precoce dell’adesione cellulare e la diffusione delle cellule dipendenti dall’ancoraggio sulla fibronectina. Inoltre, questo saggio può essere utilizzato per studiare gli effetti dell’omeostasi redox alterata sulla diffusione cellulare e/o sulle vie di segnalazione intracellulare correlate all’adesione alle cellule.

Abstract

L’adesione e la diffusione delle cellule sulla matrice extracellulare (ECM) sono processi cellulari essenziali durante lo sviluppo dell’organismo e per l’omeostasi dei tessuti adulti. È interessante notare che lo stress ossidativo può alterare questi processi, contribuendo così alla fisiopatologia di malattie come il cancro metastatico. Pertanto, comprendere i meccanismi di come le cellule si attaccano e si diffondono sull’ECM durante le perturbazioni nello stato di redox può fornire informazioni sugli stati normali e della malattia. Descritto di seguito è un protocollo graduale che utilizza un saggio basato sull’immunofluorescenza per quantificare specificamente l’adesione cellulare e la diffusione di cellule fibroblaste immortalate sulla fibronectina (FN) in vitro. In breve, le cellule dipendenti dall’ancoraggio sono tenute in sospensione ed esposte all’inibitore della chinasi ATM Ku55933 per indurre lo stress ossidativo. Le celle vengono quindi placcate su superficie rivestita FN e possono essere attaccate per periodi di tempo predeterminati. Le cellule che rimangono attaccate sono fisse ed etichettate con marcatori anticorpi basati sulla fluorescenza di adesione (ad esempio, paxillin) e diffusione (ad esempio, F-actin). L’acquisizione e l’analisi dei dati vengono eseguite utilizzando apparecchiature di laboratorio comunemente disponibili, tra cui un microscopio a epifluorescenza e un software Fiji liberamente disponibile. Questa procedura è altamente versatile e può essere modificata per una varietà di linee cellulari, proteine ECM, o inibitori al fine di esaminare una vasta gamma di domande biologiche.

Introduction

Le adeguarzioni cellula-matrice (ad esempio, le adeguarzioni focali) sono grandi e dinamiche complessi proteici multimolecolari che mediano l’adesione e la diffusione cellulare. Questi processi sono fondamentali per lo sviluppo dei tessuti, la manutenzione e la funzione fisiologica. Le adere focali sono composte da recettori legati alla membrana, come le integrine, così come le proteine dell’impalcatura che collegano l’actina citoscheletrica alla matrice extracellulare (ECM)¹. Questi complessi sono in grado di rispondere ai segnali fisiochimici presenti nell’ambiente extracellulare attraverso l’attivazione di varie vie di trasduzione di segnalazione. Come tale, le adesioni focali servono come centri di segnalazione per propagare segnali meccanici extracellulari in una serie di processi cellulari tra cui la migrazione diretta, la regolazione del ciclo cellulare, la differenziazione e la sopravvivenza^1,2. Un gruppo di molecole di segnalazione che regolano e interagiscono con le ademioni focali includono membri della famiglia Rho di piccole GTPases. Rho GTPases sono proteine chiave che regolano la migrazione cellulare e la dinamica di adesione attraverso la loro specifica attivazione spatiotemporale³. Non sorprendentemente, la disregolazione della funzione della proteina Rho è stata implicata in una serie di patologie umane come metastasi, angiogenesi e altri. Di particolare interesse, lo stato di redox cellulare svolge un ruolo predominante nella modulazione della migrazione cellulare e dell’adesione. Sono state dimostrate alterazioni nell’omeostasi redox, come l’aumento delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), per regolare l’attività della proteina Rho, così come l’adesione, in un certo numero di tipi di cellule e malattie umane^{4,5,6 ,7,8}. Ad esempio, gli individui affetti dal disturbo neurologico ataxia-telangiectasia (A-T), che è causato da una mutazione del danno del DNA riparare serina / trenina chinasi A-T-mutato (ATM), hanno un aumentato rischio di cancro metastatico^{9, 10}. La perdita di attività della chinasi ATM in questi pazienti e linee cellulari, sia per mutazione genetica che per inibizione chimica, si traduce in alti livelli di stress ossidativo a causa della disfunzione del percorso del fosfato pentozoico^{7,11, 12}. Inoltre, recenti studi del laboratorio hanno evidenziato un ruolo patofisiologico per ROS in A-T alterando la dinamica citoscheletrica (ad esempio adesione e diffusione) come risultato diretto dell’attivazione di Rho family GTPases in vitro⁵. In definitiva, queste alterazioni nelle dinamiche citoscheletriche causate dall’attivazione della famiglia Rho possono portare all’aumento del rischio di cancro metastatico osservato nei pazienti A-T^5,13. Pertanto, comprendere l’interazione tra le interazioni cellula-matrice durante lo stress ossidativo può fornire informazioni sulla regolazione dell’adesione e della diffusione. Questi studi possono anche mettere in stadio per ulteriori indagini su un possibile ruolo per la famiglia Rho GTPases in questi processi di segnalazione.

Descritto qui è un protocollo per studiare la dinamica cellulare precoce dell’assemblaggio dell’adesione e della diffusione durante lo stress ossidativo causato dall’inibizione dell’attività della chinasi ATM. Questo test si basa sul meccanismo ben caratterizzato dell’adesione delle cellule dipendenti dall’ancoraggio alla fibroctina della proteina ECM (FN). Quando le cellule mantenute in sospensione sono placcate su FN, diversi Rho GTPases coordinano il controllo dell’actin citoskeletal rimodellamento^3,14. I cambiamenti morfologici si osservano quando le cellule si spostano da rotonde e circolari nell’aspetto a appiattite ed espanse. Concomitanti con queste osservazioni è lo sviluppo di numerose adeguarsi matrice con l’ECM. Questi cambiamenti sono attribuiti all’attivazione bifasica di RhoA con Rac1 durante la prima ora man mano che le cellule aderiscono e si diffondono ^15,16.

Una varietà di metodi sono stati utilizzati per esaminare la morfologia e la dinamica dell’adesione, nonché la diffusione delle cellule. Tuttavia, questi metodi si basano su sofisticati sistemi di microscopia a lunga e lunga durata, a immagine reale di riflessione interna (TIRF) o microscopia confocale. Pertanto, gli utenti devono avere accesso a apparecchiature e software specializzati. Inoltre, il tempo di creazione richiesto da questi sistemi di bio-imaging rende difficile l’acquisizione di eventi di adesione precoce, soprattutto quando si testano più inibitori o condizioni di trattamento contemporaneamente.

I metodi descritti, nel presente documento, forniscono un modo semplice, economico, ma quantitativo per valutare i parametri che regolano l’assemblaggio dell’adesione e la diffusione in vitro. Il protocollo viene eseguito utilizzando apparecchiature di laboratorio comunemente disponibili, come un microscopio a epifluorescenza e una telecamera CCD. Questo saggio prevede l’applicazione di cellule dipendenti dall’ancoraggio a una superficie rivestita con FN dopo un periodo di stress ossidativo causato dall’inibizione chimica dell’attività della chinasi ATM, che è stato dimostrato in precedenza⁵. Dopo la placcatura, le cellule possono attaccare e aderire per periodi di tempo specificati. Le cellule non attaccate vengono lavate via, mentre le cellule attaccate sono fisse ed etichettate con anticorpi basati sulla fluorescenza ai marcatori di adesione (ad esempio, paxillin) e diffusione (ad esempio, F-actin)^2,5. Queste proteine vengono quindi visualizzate e registrate utilizzando un microscopio a epifluorescenza. L’analisi dei dati successiva viene eseguita utilizzando il software Fiji liberamente disponibile. Inoltre, questo metodo può essere adattato per esaminare le dinamiche di adesione in una vasta gamma di condizioni, tra cui diverse proteine ECM, il trattamento con vari ossidanti / condizioni di coltura cellulare o una varietà di linee cellulari dipendenti dall’ancoraggio per affrontare un’ampia gamma di domande biologiche.

Protocol

1. Preparativi NOTA: Il protocollo descritto di seguito è stato ottimizzato per l’uso con le cellule REF52 e ATMo ATM-/– fibroblasti umani. Altri tipi di celle possono richiedere un’ulteriore ottimizzazione, come descritto nelle note e nelle sezioni di risoluzione dei problemi riportate di seguito. Crea 500 mL di supporto di coltura cellulare completo per le celle REF52. A 500 mL di alto glucosio contenente il mezzo dell’Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) ag…

Representative Results

Uno schema generale dell’allestito sperimentale La figura 1 rappresenta lo schema generale per l’adesione cellulare e il protocollo di diffusione che iniziano con la fame del siero delle cellule REF52 e terminano con l’analisi computazionale delle immagini di fluorescenza acquisite. I passaggi chiave del protocollo sono illustrati nella sequenza temporale. Va notato, il passaggio 2 del protocollo descrive la preparazione dei coprilabbra rivestiti FN, che devono esse…

Discussion

Il protocollo qui descritto è un modo versatile ed economico per vagliare rapidamente una serie di tipi di cellule dipendenti dall’ancoraggio per il rimodellamento dinamico del citoscheletro durante la diffusione delle cellule. In particolare, questo metodo esamina quantitativamente la fibra di stress e la formazione di adesione focale durante lo stress ossidativo quando le cellule aderiscono al FN (Figura 1A). Inoltre, questi fenotipi cellulari possono suggerire un ruolo normativo per i me…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25300-054	cell dissociation
10 cm2 dishes	Cell Treat	229620	sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes	Fisher Scientific	05-539-5	sterile
1X Phosphate Buffered Saline	Corning Cellgro	21-031-CV	PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates	Fisher Scientific	07-200-740	sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator	Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)	BD Transduction Laboratories	610620	marker of focal adhesions
Aspirator	Argos	EV310
Biosafety cabinet	Nuair	NU-477-400	Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder	Fisher Scientific	BP9704-100	dlBSA
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100	organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose	Fisher Scientific	11965092	REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	16000044	certified, cell culture medium supplement
Fiji	National Institutes of Health	http://fiji.sc/	image analysis program
Filter syringe	Fisher Scientific	6900-2502	0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5)	Fisher Scientific	12-545-81	autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum	Gibco by Life Technologies	16210-064	component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-107	for cell counting
Human Plasma Fibronectin	Gibco by Life Technologies	33016-015	FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope	Olympus		microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933	Sigma-Aldrich	SML1109-25MG	ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera	Optimos
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15-140-122	P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)	Invitrogen	A12381	marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI	Invitrogen	P36941	cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells			Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control	Corning Incorporated	PC-420D
Syringe	BD Biosciences	309653	60 mL syringe
Tissue culture incubator	Nuair
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution	Fisher Scientific	15-250-061	for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x)	Gibco by Life Technologies	R-002-100	TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator	Fisher Scientific	11-676-341
water bath	Fisher Scientific	FSGPD02