Summary

Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo

Published: October 13, 2019
doi:

Summary

Este método é útil para quantificar a dinâmica precoce da adesão celular e disseminação de células dependentes de ancoragem para a fibronectina. Além disso, este ensaio pode ser usado para investigar os efeitos da homeostase redox alterada na propagação da pilha e/ou nas vias de sinalização intracelular adesão-relacionadas da pilha.

Abstract

A adesão e disseminação de células para a matriz extracelular (ECM) são processos celulares essenciais durante o desenvolvimento organizador e para a homeostase de tecidos adultos. Curiosamente, o estresse oxidativo pode alterar esses processos, contribuindo assim para a fisiopatologia de doenças como o câncer metastático. Conseqüentemente, compreender o mecanismo (s) de como as pilhas anexam e espalham no ECM durante as perturbações no status redox pode fornecer a introspecção em Estados normais e da doença. É descrito abaixo um protocolo passo-sábio que utilize um ensaio immunofluorescence-baseado para quantificar especificamente a adesão e a propagação da pilha de pilhas imortalizado do fibroblasto no fibronectina (FN) in vitro. Brevemente, as células dependentes de ancoragem são mantidas em suspensão e expostas ao inibidor da quinase ATM Ku55933 para induzir o estresse oxidativo. As pilhas são chapeadas então na superfície FN-revestida e permitidas anexar por períodos de tempo predeterminados. As células que permanecem ligadas são fixas e rotuladas com marcadores de anticorpos de adesão à base de fluorescência (por exemplo, paxillin) e espalhamento (por exemplo, F-Actina). A aquisição e a análise dos dados são executadas usando o equipamento de laboratório geralmente disponível, incluindo um microscópio da epifluorescência e software livremente disponível de Fiji. Este procedimento é altamente versátil e pode ser modificado para uma variedade de linhas celulares, proteínas de ECM, ou nervos inibidores a fim examinar uma escala larga de perguntas biológicas.

Introduction

Aderências de matriz celular (ou seja, aderências focais) são grandes e dinâmicos complexos proteicos multimoleculares que mediam a adesão e disseminação celular. Estes processos são críticos para o desenvolvimento do tecido, a manutenção, e a função physiological. As aderências focais são compostas de receptores ligados à membrana, como as integrinas, bem como as proteínas de andaimes que ligam a actina citoesquelética à matriz extracelular (ECM)1. Esses complexos são capazes de responder a pistas fisioquímicas presentes no ambiente extracelular através da ativação de várias vias de transdução de sinalização. Como tal, as aderências focais servem como centros de sinalização para propagar pistas mecânicas extracelulares em vários processos celulares, incluindo migraçãodirecionada, regulaçãodo ciclo celular, diferenciação e sobrevida1,2. Um grupo de moléculas de sinalização que regulam e interagem com aderências focais inclui membros da família Rho de pequenos GTPases. As GTPases Rho são proteínas-chave que regulam a migração celular e a dinâmica de aderência através de sua ativação espaciotemporal específica3. Não surpreendentemente, a desregulação da função da proteína Rho tem sido implicada em um número de patologias humanas, tais como metástases, angiogênese, e outros. De particular interesse, o status redox celular desempenha um papel predominante na modulação da migração celular e adesão. Alterações na homeostase redox, como aumentos de espécies reativas de oxigênio (ROS), têm sido demonstradas para regular a atividade protéica de Rho, bem como adesão, em um número de tipos de células e doenças humanas4,5,6 ,7,8. Por exemplo, indivíduos que sofrem da desordem neurológica ataxia-Telangiectasia (A-T), que é causada por uma mutação no reparo de danos de DNA serina/treonina quinase A-T-Mutated (ATM), têm um risco aumentado de câncer metastático9, a 10. A perda da atividade da quinase ATM nesses pacientes e linhagens celulares, seja por meio da mutação genética ou da inibição química, resulta em altos níveis de estresse oxidativo devido à disfunção da via de fosfato pentose7,11, doze anos. Além disso, os estudos recentes do laboratório destacaram um papel patofisiológico para ROS em A-T alterando a dinâmica do cytoesquelético (isto é. adesão e espalhar) como um resultado direto de ativar GTPases da família de Rho in vitro5. Em última análise, essas alterações na dinâmica citoesquelética causadas pela ativação da família Rho podem levar ao aumento do risco de câncer metastático observado em pacientes com A-T5,13. Portanto, compreender a interação entre as interações célula-matriz durante o estresse oxidativo pode fornecer insights sobre a regulação da adesão e disseminação. Estes estudos podem igualmente ajustar o estágio para umas investigações mais adicionais em um papel possível para GTPases da família de Rho nestes processos de sinalização.

Descrito aqui é um protocolo para estudar a dinâmica celular precoce do conjunto de aderência e disseminação durante o estresse oxidativo causado pela inibição da atividade da quinase ATM. Este ensaio baseia-se no mecanismo bem caracterizado de adesão de células dependentes de ancoragem à fibronectina de proteína ECM (FN). Quando as células mantidas em suspensão são chapeadas na FN, vários Rho GTPases coordenam o controledo remodelamentocitoesquelético de actina14,15. Alterações morfológicas são observadas à medida que as células mudam de volta e circulares na aparência para achatado e expandido. Concomitante com estas observações é o desenvolvimento de aderências numerosas da matriz com o ECM. Essas alterações são atribuídas à ativação bifásica de Rhoa com Rac1 durante a primeira hora em que as células aderem e se espalham 15,16.

Uma variedade de métodos tem sido utilizada para examinar a morfologia da adesão e dinâmica, bem como a propagação celular. No entanto, esses métodos dependem de sistemas sofisticados de fluorescência de reflexão interna (TIRF) ou de microscopia confocal de longo prazo e de imagem viva. Assim, os usuários devem ter acesso a equipamentos e softwares especializados. Além disso, o tempo de set-up exigido por esses sistemas de bioimagem torna a captura de eventos de adesão precoce desafiador, especialmente quando o teste de múltiplos inibidores ou condições de tratamento simultaneamente.

Os métodos detalhados, aqui, fornecem uma maneira direta, econômica, contudo quantitativa de avaliar os parâmetros que governam o conjunto da adesão e que espalham in vitro. O protocolo é realizado usando equipamentos laboratoriais comumente disponíveis, como um microscópio de epifluorescência e câmera CCD. Este ensaio envolve a aplicação de células dependentes de ancoragem a uma superfície revestida com FN após um período de estresse oxidativo causado pela inibição química da atividade da quinase ATM, que tem sido demonstrada anteriormente5. Após o chapeamento, as células são permitidas para anexar e aderir para comprimentos especificados de tempo. As células não anexadas são lavadas, enquanto as células anexadas são fixas e marcadas com anticorpos à base de fluorescência para marcadores de aderência (por exemplo, paxillin) e espalhamento (por exemplo, F-Actina)2,5. Essas proteínas são então visualizadas e gravadas usando um microscópio de epifluorescência. A análise de dados subseqüente é executada usando o software livremente disponível de Fiji. Além disso, este método pode ser adaptado para examinar a dinâmica de adesão uma ampla gama de condições, incluindo diferentes proteínas de ECM, tratamento com vários oxidantes/condições de cultura celular ou uma variedade de linhas celulares dependentes de ancoragem para abordar uma ampla gama de questões biológicas.

Protocol

1. os preparativos Nota: o protocolo descrito abaixo foi otimizado para o uso com células REF52 e ATM+/+ ou ATM-/- fibroblastos humanos. Outros tipos de célula podem exigir mais otimização conforme descrito nas seções de anotações e solução de problemas abaixo. Faça 500 mL de meio de cultura celular completo para células REF52. Para 500 mL de alta-glicose contendo Dulbecco ‘ s modificado Eagle ‘ s médio (DMEM) adicionar 10% FBS, 2 mM L-glutamina, e …

Representative Results

Um esquema geral da set-up experimental A Figura 1 representa o esquema geral para a adesão da célula e o protocolo de espalhamento começando com a inanição sérica de células REF52 e terminando com a análise computacional de imagens de fluorescência adquiridas. As etapas principais no protocolo são ilustradas na linha do tempo. Da nota, a etapa 2 do protocolo descreve a preparação dos COVERSLIP FN-revestidos, que devem ser executados simultaneamente com …

Discussion

O protocolo descrito aqui é uma maneira versátil e econômica de tela ràpida uma série de tipos ancoragem-dependentes da pilha para o citoesqueleto dinâmico que remodela durante espalhar da pilha. Em particular, este método examina quantitativamente a fibra de estresse e a formação de adesão focal durante o estresse oxidativo quando as células aderem à FN (Figura 1a). Além disso, estes fenótipos celulares podem sugerir um papel regulamentar para membros da família de Rho de GTP…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem aos Drs. Scott R. Hutton e Meghan S. Blackledge pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela High Point University ‘ s Research and patrocinado Programs (MCS) e o programa de biotecnologia da North Carolina State University (MCS).

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x) Gibco by Life Technologies 25300-054 cell dissociation
10 cm2 dishes Cell Treat 229620 sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes Fisher Scientific 05-539-5 sterile
1X Phosphate Buffered Saline Corning Cellgro 21-031-CV PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates Fisher Scientific 07-200-740 sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) BD Transduction Laboratories 610620 marker of focal adhesions
Aspirator Argos EV310
Biosafety cabinet Nuair NU-477-400 Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder Fisher Scientific BP9704-100 dlBSA
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231-100 organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose Fisher Scientific 11965092 REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum Fisher Scientific 16000044 certified, cell culture medium supplement
Fiji National Institutes of Health http://fiji.sc/ image analysis program
Filter syringe Fisher Scientific 6900-2502 0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5) Fisher Scientific 12-545-81 autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum Gibco by Life Technologies 16210-064 component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer Fisher Scientific 22-600-107 for cell counting
Human Plasma Fibronectin Gibco by Life Technologies 33016-015 FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope Olympus microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933 Sigma-Aldrich SML1109-25MG ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera Optimos
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) Invitrogen A12381 marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36941 cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control Corning Incorporated PC-420D
Syringe BD Biosciences 309653 60 mL syringe
Tissue culture incubator Nuair
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution Fisher Scientific 15-250-061 for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x) Gibco by Life Technologies R-002-100 TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator Fisher Scientific 11-676-341
water bath Fisher Scientific FSGPD02

References

  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
  3. Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
  4. Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
  5. Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
  6. Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
  8. Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
  9. Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
  10. Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
  11. Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
  12. Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
  13. Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
  14. Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
  15. Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
  16. Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
  17. Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
  18. Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
  19. Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
  20. Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
  21. Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
  22. Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
  23. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
  24. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  25. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  26. Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
  27. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  28. Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
  29. Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).

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Tolbert, C. E., Palmquist, L., Dixon, H. L., Srougi, M. C. Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (152), e59989, doi:10.3791/59989 (2019).

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