Изучение динамики клеточной адгезии и распространения эпителиальных клеток на фибронектин во время окислительного стресса
Summary
Этот метод полезен для количественной оценки ранней динамики клеточной адгезии и распространения якорно-зависимых клеток на фибронектин. Кроме того, этот анализ может быть использован для расследования влияния измененного редокс гомеостаза на распространение клеток и / или клеточной адгезии, связанные с внутриклеточной сигнальных путей.
Abstract
Прилипание и распространение клеток на внеклеточной матрицы (ECM) являются важными клеточными процессами во время развития организма и для гомеостаза тканей взрослых. Интересно, что окислительный стресс может изменить эти процессы, тем самым способствуя патофизиологии таких заболеваний, как метастатический рак. Таким образом, понимание механизма (ы) того, как клетки прикрепляются и распространяются на ECM во время возмущений в статусе Redox может обеспечить понимание нормальных и заболеваний состояний. Ниже описан пошаговой протокол, который использует иммунофлуоресценции на основе анализа, чтобы конкретно количественно клеточной адгезии и распространения увековеченных клеток фибробластов на фибронектин (FN) в пробирке. Вкратце, якорно-зависимые клетки держатся в подвеске и подвергаются воздействию ингибитора киназы ATM Ku55933 для индуцирования окислительного стресса. Клетки затем покрываются на поверхности с покрытием FN и позволяют прикрепляться в течение предопределенных периодов времени. Клетки, которые остаются прилагается фиксированной и помечены флуоресценции на основе антител маркеров адгезии (например, паксиллин) и распространение (например, F-актин). Сбор и анализ данных осуществляется с использованием общедоступного лабораторного оборудования, включая микроскоп по эпифлюоресценции и свободно доступное программное обеспечение Фиджи. Эта процедура является весьма универсальной и может быть изменена для различных клеточных линий, белков ECM или ингибиторов для изучения широкого спектра биологических вопросов.
Introduction
Клеточные матричные спайки (т.е. очаговые спайки) представляют собой крупные и динамические многомолекулярные белковые комплексы, которые посреднику клеточной сцепления и распространения. Эти процессы имеют решающее значение для развития тканей, поддержания и физиологической функции. Фокусные спайки состоят из мембранных рецепторов, таких как целы, а также строительных лесов белков, которые связывают цитоскелет актин с внеклеточной матрицы (ECM)1. Эти комплексы способны реагировать на физиохимические сигналы, присутствующие во внеклеточной среде, путем активации различных сигнальных путей трансдукции. Таким образом, координационные спайки служат в качестве сигнальных центров для распространения внеклеточных механических сигналов в ряд клеточных процессов, включая направленную миграцию, регулирование клеточного цикла, дифференциацию и выживание1,2. Одна группа сигнальных молекул, которые регулируют и взаимодействуют с координационными спайсами, включает в себя членов семейства Rho малых GTPases. Rho GTPases являются ключевыми белками, которые регулируют миграцию клеток и динамику адгезии через их специфическую пространственно-временной активации3. Неудивительно, что дисрегуляция функции белка Rho была вовлечена в ряд человеческих патологий, таких как метастаз, ангиогенез, и другие. Особый интерес представляет клеточный статус редокса, который играет доминирующую роль в модуляции миграции клеток и сливок. Изменения в редокс гомеостаза, такие как увеличение реактивных видов кислорода (ROS), были продемонстрированы для регулирования активности белка Rho, а также сливки, в ряде типов клеток и заболеваний человека4,5,6 ,7,8. Например, лица, страдающие от неврологического расстройства атаксия-телеангиэктазия (A-T), который вызван мутацией в восстановлении повреждения ДНК serine/threonine kinase A-T-mutated (ATM), имеют повышенный риск метастатического рака9, 10. Потеря активности атм киназы у этих пациентов и клеточных линий, либо через генетическую мутацию или химическое ингибирование, приводит к высокому уровню окислительного стресса из-за дисфункции пентозы фосфата путь7,11, 12. Кроме того, недавние исследования из лаборатории выявили патофизиологическую роль ДЛЯ ROS в A-T путем изменения динамики цитоскелета (т.е. схватки и распространения) как прямой результат активации Rho семьи GTPases в пробирке5. В конечномсчете, эти изменения в динамике цитоскелета, вызванные активацией семьи Rho, могут привести к повышенному риску развития метастатического рака, отмеченного у пациентов А-Т5,13. Таким образом, понимание взаимодействия между клеточными матричными взаимодействиями во время окислительного стресса может дать представление о регуляции слипа и распространения. Эти исследования могут также заложить основу для дальнейших исследований возможной роли семьи Rho GTPases в этих сигнальных процессах.
Описанный в настоящем виде протокол для изучения ранней клеточной динамики сборки адгезии и распространения во время окислительного стресса, вызванного ингибированием активности киназы АТМ. Этот анализ основан на хорошо охарактеризованном механизме крепления якорно-зависимых клеток к фибронектину белка ECM (FN). Когда клетки, поддерживаемые в подвеске, покрываются на FN, несколько Rho GTPases координируют контроль актина цитоскелета ремоделирования3,14. Морфологические изменения наблюдаются по мере того, как клетки переходят от круглых и круговых по внешнему виду к сплющенному и расширенному. Одновременно с этими наблюдениями происходит разработка многочисленных матричных спаек с ECM. Эти изменения связаны с двухфамной активации RhoA с Rac1 в течение первого часа, как клетки придерживаются и распространяются 15,16.
Различные методы были использованы для изучения морфологии адгезии и динамики, а также распространение клеток. Тем не менее, эти методы опираются на сложные долгосрочные, живой визуализации общего внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) или конфокальной микроскопии систем. Таким образом, пользователи должны иметь доступ к специализированному оборудованию и программному обеспечению. Кроме того, время настройки, требуемое этими био-изображениясистемделает захват ранних событий сцепения сложной задачей, особенно при одновременном тестировании нескольких ингибиторов или условий лечения.
Методы, детализированные, в настоящем ива, обеспечивают простой, экономичный, но количественный способ оценки параметров, которые регулируют сборку стыковки и распространения в пробирке. Протокол выполняется с использованием широко доступного лабораторного оборудования, например, эпифлюоресцентного микроскопа и CCD-камеры. Этот анализ включает в себя применение якорно-зависимых клеток к FN покрытием поверхности после периода окислительного стресса, вызванного химическим ингибированием активности киназы АТМ, которая была продемонстрирована ранее5. После покрытия, клетки могут прикрепляться и придерживаться в течение определенного периода времени. Непривязанные клетки смываются, в то время как прикрепленные клетки фиксируются и маркируются антителами на основе флуоресценции к маркерам адгезии (например, паксиллин) и распространяются (например, F-актин)2,5. Эти белки затем визуализированы и записаны с помощью эпифлюоресцентного микроскопа. Последующий анализ данных проводится с использованием свободно доступного программного обеспечения Фиджи. Кроме того, этот метод может быть адаптирован для изучения динамики адгезии в широком диапазоне условий, включая различные белки ECM, лечение различными условиями окислителей/клеточной культуры или различных якорно-зависимых клеточных линий для решения широкого спектра биологические вопросы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол является универсальным и экономичным способом быстрого скрининга ряда типов якорных клеток для динамической ремоделирования цитоскелетов во время распространения клеток. В частности, этот метод количественно исследует стрессовые волокна и образование коор…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят доктора Скотта Р. Хаттона и Меган С. Блэкледж за критический обзор рукописи. Эта работа была профинансирована исследованиями и спонсорскими программами Университета Хай-Пойнта (MCS) и Программой биотехнологии в Университете штата Северная Каролина (MCS).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
- Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
- Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
- Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
- Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
- Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
- Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
- Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
- Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
- Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
- Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
- Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
- Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
- Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
- Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
- Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
- Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
- Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
- Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
- Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
- Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
- Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).
