מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים
Summary
כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג’לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.
Abstract
Durotaxis היא התהליך שבו התאים חשים ולהגיב מעברי מדרגות של מתח. כדי ללמוד את התהליך הזה בתוך מבחנה, הנוקשות של המצע שבבסיס תא חייב להיות מניפולציות. בעוד הידרוג’לים עם נוקשות מדורגת הגירה ארוכת טווח הוכיחה הוכיחו שימושי במחקרים durotaxis, מיידית, התגובות אקוטי שינויים מקומיים במתח המצע לאפשר מחקר ממוקד של תנועות תאים בודדים ו subcellular האירועים איתות. כדי לבחון באופן מובן מאליו את היכולת של תאים לחוש ולהגיב קשיות המצע הבסיסי, שיטה שונה עבור יישום של מעברי צבע חריפה של מתח מוגבר לתאים בודדים תרבותי על deformable הידרוג’לים משמש אשר מאפשר בזמן אמת מניפולציה של כוח וכיוון של מעברי צבע נוקשות הנחיתעל התאים המדובר. בנוסף, בסדר כוונון הפרטים והפרמטרים של המילוי, כגון הצורה והממדים של המיקרופיפטה או המיקום היחסי, המיקום והכיוון של הדרגתי המוחל, ניתן למטב את האפשרות למחקר של כל מכני סוג תא ומערכת רגישים. פרמטרים אלה ניתנים לשינוי כדי לשנות באופן אמין את הגירוי שהוחל ולהרחיב את הפונקציונליות ואת הרב-תכליתיות של התיקון. שיטה זו מאפשרת בדיקה של תנועת durotactic ארוכת טווח, כמו גם שינויים מיידיים יותר של איתות סלולרי ודינמיקה מורפולוגית בתגובה נוקשות שינוי.
Introduction
במהלך העשורים האחרונים, חשיבותו של התכונות המכאניות של סביבת התא צברה הכרה גוברת בביולוגיה של התא. רקמות שונות מטריצות מסחטות יש מאפיינים שונים היחסיים, כמו תאים להעביר ברחבי הגוף, הם מנווטים שינויים אלה, באמצעות תכונות מכניות אלה כדי להנחות אותם1,2,3 , ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. תאים להשתמש הנוקשות של רקמה נתונה כדי להודיע על התנהגות נעים שלהם במהלך תהליכים כגון פיתוח, פצע ריפוי, סרטן גרורות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המאפשרים תחושת ותגובה לתשומות המכאניות הללו נותרו בעיקר בלתי ידועים1,2,3,4,5, מיכל בן 6 , 7. לאחר מכן
על מנת ללמוד את המנגנונים שדרכם תאים להגיב לרמזים סביבתיים פיזיים, קשיחות או נוקשות של המצע התאים המשמשים לטיפול בתאי מטופל חייב להיות מניפולציות. בשנת 2000, Chun-Min Lo, יו-לי וואנג ועמיתיו פיתחו שיטת הפעולה8 לפיה התגובה של תא בודד מורצפת לשינוי רמזים מכניים יכול להיבדק ישירות על ידי מתיחת מטריצה deformable המגולוון (ecm) מצופה אלקטרופורזה הידרוג’לים שבהם התאים היו מצופים. התאים מוצגים בהעדפה משמעותית למעבר לכיוון מצעים של סטיפר, תופעה שכונתה “דורוקמוניות”.
מאז הדו ח המקורי ב 2000, טכניקות רבות אחרות המועסקים לחקר durotaxis. מעברי הקשיות הקשים מיוצרים על ידי השלכת ג’לים על תכונות נוקשות כגון פוליסטירן חרוזים9 או הודעות פולימר נוקשה10 או על ידי פולימריות המצע סביב הקצוות של שמיכות זכוכית11 כדי ליצור מכני ‘ צעד-גבולות ‘. לחילופין, הידרוג’לים עם רדודים אבל מעברי קשיות קבוע כבר מפוברק על ידי מגוון של שיטות כגון מעברי החוצה של crosslinker קשר שנוצר על ידי התקנים microfluidic12,13 או זה לצד-ידי צד הידרוג פתרון טיפות של נוקשות שונים8, או הידרוג ‘ ו עם פוטוראקטיבית crosslinker קשר מטופלים עם חשיפה אור UV מדורגים ליצור קשיות ליניארי מעבר הצבע14,15. טכניקות אלה שימשו השפעה רבה כדי לחקור את התנועה התאית durotactic en המסה לאורך זמן. עם זאת, בדרך כלל תכונות אלה מפוברק מראש של ציפוי התא המאפיינים שלהם נשארים עקביים במהלך הניסוי, הסתמכות על תנועה אקראית אקראי לדיגום של מעברי צבע מכניים. אף אחת מהשיטות הללו אינה קלה להתבוננות בשינויים מהירים בהתנהגות התאית בתגובה לגירוי מכני חריף.
כדי להתבונן בתגובות הסלולר לשינויים חריפים בסביבה המכנית, היחידה הניידת מציעה מספר יתרונות. בעלי התכונות האלה, תאים בודדים מקבלים גירוי מכני חריף על ידי משיכת המצע הבסיסי הרחק מתא עם מיקרופיפטה זכוכית, ובכך מציג מעבר כווני של מתח תא מטריקס. שינויים בהתנהגות המוליכה, כגון מהירות או כיוון הגירה, נצפו לאחר מכן על-ידי מיקרוסקופ ניגודיות בפאזה חיה. גישה זו מקלה על התבוננות ישירה של הגורם וההשפעה בין גירויים מכניים להעברת תאים, כיוון שהיא מאפשרת מניפולציה מהירה ואיטרטיבית של הכיוון והגודל של המתח הדרגתי והערכת הסוגר תגובות הסלולר בזמן אמת. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש גם לעירור מכני התאים המבטא היתוך פלורסנט חלבונים או אנלייזרים להמחיש שינויים בכמות, פעילות, או לוקליזציה subcellular של חלבונים החשודים להיות מעורבים בתהליך המכונה ו . מונית מדבר
טכניקה זו הועסק על ידי קבוצות אשר לומדים durotaxis8,16 והוא מתואר כאן כפי שהוא הותאם על ידי המעבדה האו ללמוד את ההתנהגות durotaxis של סקוב-3 תאים סרטניים בשחלות ואת המנגנונים המולקולריים ש מוניות מתחתלגיל 17 בנוסף, שיטה ששונתה מתוארת לייצור הידרוג’לים עם שכבה אחת, אפילו של מיקרוספירות פלורסנט ליד פני השטח של תרבות התא; זה מקל על ויזואליזציה ואופטימיזציה של מיקרופיפטה שנוצר מעברי הלחץ והוא עשוי לאפשר הערכה של הקונקטיקות התא על ידי כוח המתיחה מיקרוסקופ.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפגינו כאן היא מערכת הניתן לשחזור, תא בודד שיטת הפעולה המאפשרת הערכה של היכולת של התא לשנות את התנהגותו הגירה בתגובה רמזים מכניים חריפה. טכניקה זו יכולה לשמש גם בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית וחלבונים היתוך המתאים או אנלייזרים לבחון את האותות הסלולריים והשלד האירועים בתוך שניות של גיר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
לא.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. 발생학. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
