Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal
Summary
Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para inducir una lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacáridos intratraqueales y para realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar y tejido pulmonar. La mínima invasividad, el manejo simple, la buena reproducibilidad y la valoración de la gravedad de la enfermedad son ventajas de este enfoque.
Abstract
La administración de lipopolisacáridos (LPS) es una forma común de estudiar la inflamación pulmonar y la lesión pulmonar aguda (ALI) en modelos animales pequeños. Se han descrito varios enfoques, como la inhalación de LPS aerosolizado, así como la insculación nasal o intratraal. El protocolo presentado describe un procedimiento detallado paso a paso para inducir la ALI en ratones mediante la insinfección directa de LPS intratraqueal y realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar (BAL) y tejido pulmonar. Después de la sedación intraperitoneal, la tráquea se expone y el LPS se administra a través de un catéter venoso de 22 G. Una reacción inflamatoria robusta y reproducible con invasión de leucocitos, regulación ascendente de las citoquinas proinflamatorias, y la interrupción de la barrera alveolo-capilar se induce dentro de horas a días, dependiendo de la dosis de LPS utilizado. La recolección de muestras de sangre, el líquido BAL y la recolección pulmonar, así como el procesamiento para el análisis de FACS, se describen en detalle en el protocolo. Aunque el uso del LPS estéril no es adecuado para estudiar intervenciones farmacológicas en enfermedades infecciosas, el enfoque descrito ofrece una mínima invasividad, un manejo sencillo y una buena reproducibilidad para responder a preguntas inmunológicas mecanicistas. Además, la valoración de la dosis, así como el uso de preparaciones alternativas de LPS o cepas de ratón permiten la modulación de los efectos clínicos, que pueden exhibir diferentes grados de gravedad de la ALI o temprano frente a la aparición tardía de los síntomas de la enfermedad.
Introduction
Los modelos animales experimentales son indispensables en la investigación inmune básica. La administración de bacterias enteras o componentes microbianos se ha utilizado con frecuencia en modelos animales pequeños para inducir inflamación local o sistémica1. El lipopolisacárido (LPS, o endotoxina bacteriana) es un componente de pared celular y antígeno superficial de bacterias gramnegativas (por ejemplo, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., o Legionella spp.). La molécula termoestable y grande (peso molecular 1-4 x 106 kDa) consiste en una mitad lipídica (Lípido A), región central (oligosacárido), y un polisacárido O (o antígeno O). El lípido A, con sus cadenas de ácidos grasos hidrófobos, ancla la molécula en una membrana bacteriana y media (sobre la degradación de las bacterias) la actividad inmunológica y la toxicidad de LPS. Después de la unión a la proteína de unión LPS (LBP), los complejos LPS:LBP ligan el complejo receptor CD14/TLR4/MD2 ubicado en la superficie de muchos tipos de células, induciendo una fuerte reacción proinflamatoria con translocación nuclear NF-B y posterior regulación ascendente de la expresión de citoquinas2.
La lesión pulmonar aguda (ALI) se define como insuficiencia respiratoria hipoxémica aguda con edema pulmonar bilateral en ausencia de insuficiencia cardíaca3. La administración de las vías respiratorias de LPSes una forma común de inducir inflamación pulmonar y ALI 4,5,6,7. Aunque la sustancia estéril no es adecuada para estudiar intervenciones farmacológicas en enfermedades infecciosas, las preguntas inmunológicas mecanicistas pueden responderse con una precisión adecuada. La insitación de LPS en la tráquea induce una reacción inflamatoria robusta con invasión de leucocitos, regulación ascendente de las citoquinas proinflamatorias, y la interrupción de la barrera alveolo-capilar en cuestión de horas a días, dependiendo de la dosis de LPS3, 6,7.
El protocolo presentado describe un procedimiento detallado paso a paso para inducir la ALI en ratones por instanición de LPS intratraal. El modelo ha sido validado mediante la evaluación de la expresión de citoquinas, la invasión de granulocitos neutrófilos y la fuga de albúmina intra-alveolar como se describió anteriormente8.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mínima invasividad, el manejo simple y la buena reproducibilidad son características clave del enfoque presentado para inducir ALI en un modelo de roedores pequeños. El uso de LPS en lugar de bacterias enteras en modelos animales tiene ventajas. Es un compuesto estable y puro y se puede almacenar en forma liofilizada hasta su uso. Es un potente estimulante para las respuestas inmunitarias innatas a través de la vía TLR4, y su actividad biológica puede cuantificarse fácilmente, facilitando la valoración de la g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Jan Kleiner y Susanne Schulz por proporcionar apoyo técnico. Los autores reconocen el excelente apoyo de la instalación central de citometría de flujo en la facultad de medicina de la Universidad de Bonn. Los autores no recibieron financiación de ninguna organización externa. Parte de los datos indicados en la sección de resultados y que se describen en la Figura 3 ya se han mostrado en una publicación anterior8.
Materials
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
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