Doğrudan Intratracheal Lipopolysaccharide Instilasyon ile farelerde akut akciğer hasarının İndükleme
Summary
Burada sunulan bir adım-adım prosedür doğrudan intratrakeal lipopolisakkarid instilasyon tarafından fareler akut akciğer hasarı neden ve kan örnekleri, Bronkoalveoler Lavaj sıvısı ve akciğer dokusu FACS analizi gerçekleştirmek için. Minimal invasiveness, basit kullanım, iyi reproducibility, ve hastalık şiddeti titrasyon bu yaklaşımın avantajlarıdır.
Abstract
Lipopolisakkarid (LPS) Airway yönetimi küçük hayvan modellerinde pulmoner inflamasyon ve akut akciğer hasarı (alı) incelemek için yaygın bir yoldur. Aerosolize LPS inhalasyonu ve burun ya da intratrakeal instilasyon gibi çeşitli yaklaşımlar tanımlanmıştır. Sunulan protokol, doğrudan intratrakeal LPS instıtasyon tarafından farelerde alı ‘yi teşvik etmek ve kan örnekleri, Bronkoalveoler Lavaj (bal) sıvısı ve akciğer dokusu FACS analizi gerçekleştirmek için ayrıntılı bir adım adım prosedür açıklanmaktadır. İntraperitoneal sedasyon sonrasında trakea maruz kalır ve LPS 22 G venöz kateter üzerinden uygulanır. Lökosit invazyonu ile sağlam ve tekrarlanabilir bir inflamatuar reaksiyon, proenflamatuar sitokinlerin updüzenleme ve alveolo-kapiller bariyerinin bozulması, kullanılan LPS dozaja bağlı olarak saatlerce gün içinde indüklenir. Kan numunelerinin toplanması, BAL sıvısı, ve akciğer hasat, hem de FACS analizi için işleme, protokolde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Steril LPS kullanımı bulaşıcı hastalıklarda farmakolojik müdahaleleri incelemek için uygun olmasa da, açıklanan yaklaşım, mekanik immünolojik sorulara cevap vermek için minimal invasiveness, basit kullanım ve iyi yeniden Üretilebilirlik sunar. Ayrıca, doz titrasyonu yanı sıra alternatif LPS preparatları veya fare suşları kullanımı klinik etkilerinin modülasyon izin, hangi ALI şiddeti farklı derecelerde gösterebilir veya erken vs hastalık belirtileri geç başlangıcı.
Introduction
Deneysel hayvan modelleri temel bağışıklık araştırmalarında vazgeçilmez. Tüm bakterilerin veya mikrobiyal bileşenlerin yönetilmesi, yerel veya sistemik inflamasyona yol açan küçük hayvan modellerinde sıklıkla kullanılmıştır1. Lipopolysaccharide (LPS veya bakteriyel endotoksin) bir hücre duvar bileşeni ve gram-negatif bakterilerin yüzey antijeni (örn., Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., veya Legionella spp.). Termostabil ve büyük molekül (Moleküler Ağırlık 1-4 x 106 kDa) bir lipid kısım (lipid a), çekirdek bölge (oligosaccharide) ve bir o polisakkarit (veya o antijen) oluşur. Lipid A, hidrofobik yağ asidi zincirleri ile, molekül bir bakteriyel membran ve arabulucuları (bakterilerin bozulması üzerine) immünolojik aktivite ve LPS toksisitesi ile çapa. LPS bağlama proteini (LBP), LPS: LBP kompleksleri, birçok hücre türlerinin yüzeyinde bulunan CD14/TLR4/MD2 reseptör kompleksine bağlanarak, NF-κB nükleer translokasyon ve sonraki upregülasyonu ile güçlü bir proinflamatuar reaksiyon inducing sitokin ifadesi2.
Akut akciğer hasarı (ALI) kalp yetmezliği yokluğunda bilateral pulmoner ödem ile akut hipoxemik solunum yetmezliği olarak tanımlanır3. LPS Airway yönetimi pulmoner inflamasyon ve alı4,5,6,7teşvik etmek için yaygın bir yoldur. Steril madde bulaşıcı hastalıklarda farmakolojik müdahaleler çalışmak için uygun olmasa da, mekanik immünolojik sorular yeterli hassasiyetle cevaplanabilir. LPS ‘in trakeanın içine ınbrilasyonu, lökosit invazyonu ile sağlam bir enflamatuar reaksiyon, proinflamatuar sitokinlerin updüzenleme, ve alveolo-kapiller bariyerinin saatler içinde gün içinde bozulması, LPS dozajı3‘ e bağlı olarak, 6,7.
Sunulan protokol, intratrakeal LPS instıtasyon tarafından farelerde alı ‘yi teşvik etmek için ayrıntılı bir adım adım prosedür açıklar. Model, sitokin ifadesi, nötrofil granülosit invazyonu ve intra alveoler albümin kaçağı olarak önceden açıklandığı gibi değerlendirilerek doğrulandı8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minimal invasiveness, basit elleçleme ve iyi yeniden Üretilebilirlik, küçük bir kemirgen modelde ALI ‘yi teşvik etmek için sunulan yaklaşımın temel özellikleridir. Hayvan modellerinde tüm bakterilerin yerine LPS kullanımı avantajları vardır. İstikrarlı ve saf bir bileşiktir ve kullanımına kadar liyofilize formda depolanabilir. Bu TLR4 yolu ile doğuştan gelen immün tepkiler için güçlü bir uyarıcı olduğunu, ve biyolojik aktivite kolayca nicelik olabilir, iyi reproducibility ile hastalığın …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar teknik destek sağlamak için Jan Kleiner ve Susanne Schulz teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Bonn Üniversitesi Tıp Fakültesi akış sitometri çekirdek tesis mükemmel destek kabul. Yazarlar herhangi bir dış kuruluştan hiçbir fon aldı. Sonuçlar bölümünde verilen ve Şekil 3 ‘ te tasvir edilen verilerin bir kısmı zaten önceki yayında8‘ de gösterildi.
Materials
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).
- D’Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS – approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), 378-384 (2017).
