وضع علامات محددة من النيوكليويدات الميتوكوندريا لمرور الوقت المجهر الإضاءة منظم
Summary
يصف البروتوكول وضع علامات محددة على النيوكليويدات الميتوكوندريا مع وصمة عار هلام الحمض النووي المتاحة تجاريًا ، واكتساب سلسلة مرور الوقت من الخلايا الحية المسماة بواسطة المجهر المجهري للإضاءة المهيكلة (SR-SIM) ، والتتبع التلقائي لحركة النيوكليويد.
Abstract
النيوكليويدات الميتوكوندريا هي جزيئات مدمجة تشكلت من جزيئات الحمض النووي الميتوكوندريا المغلفة بالبروتينات. الحمض النووي الميتوكوندريا ترميز tRNAs, rRNAs, والعديد من البولي ببتيدات الميتوكوندريا الأساسية. النيوكليويدات الميتوكوندريا تقسيم وتوزيع داخل شبكة الميتوكوندريا الديناميكية التي تخضع للانشطار / الانصهار وغيرها من التغيرات المورفولوجية. عالية الدقة المجهر الفلوري الحي هو تقنية مباشرة لتوصيف موقف النيوكليويد والحركة. لهذه التقنية، يتم عادة تسمية النيوكليويدات من خلال العلامات الفلورية من مكونات البروتين الخاصة بهم، وهي عامل النسخ أ (TFAM). ومع ذلك، تحتاج هذه الاستراتيجية إلى تعبير مفرط عن بنية فلورية معلمة بالبروتين، والتي قد تسبب القطع الأثرية (المبلغ عنها لـ TFAM)، وغير ممكنة في كثير من الحالات. الأصباغ العضوية الملزمة للحمض النووي ليس لديها هذه العيوب. ومع ذلك، فإنها تظهر دائما تلطيخ من كل من DNAs النووية والميتوكوندريا، وبالتالي تفتقر إلى خصوصية النيوكليويدات الميتوكوندريا. من خلال الأخذ في الاعتبار الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذه الأصباغ ، اخترنا وصمة عار هلام الحمض النووي (SYBR Gold) وحققنا وضع علامات تفضيلية على النيوكليويدات الميتوكوندريا في الخلايا الحية. خصائص الصبغة ، وخاصة سطوعها العالي عند الربط بالحمض النووي ، تسمح بالقياس الكمي اللاحق لحركة النيوكليويد الميتوكوندريا باستخدام سلسلة زمنية من صور الإضاءة المنظمة فائقة الدقة.
Introduction
تشكل جزيئات الحمض النووي الدائرية 16.5 كيلوبت في الثانية المادة الوراثية للالميتوكوندريا، وترميز 22 tRNAs، و2 rRNAs، و 13 polypeptides اللازمة لمجمعات الفوسفور التأكسدي الميتوكوندريا. الميتوكوندريا الحمض النووي ملزمة لالميتوكوندريا عامل النسخ أ (TFAM) والعديد من البروتينات الأخرى تشكل النيوكليويدات الميتوكوندريا1,2,3,4. نقل النيوكليودات الميتوكوندريا وإعادة توزيعها بين مكونات شبكة الميتوكوندريا5,6 خلال إعادة عرض مورفولوجية, الانشطار أو الانصهار اعتمادا على مرحلة دورة الخلية, الإجهاد, وعوامل أخرى (استعرضت في Pernas وآخرون7). بالإضافة إلى ذلك ، فإن حركة النيوكليويدات الميتوكوندريا ، متورطة في مرض الذئبة الليفي ةالجهازية 8 وقد تلعب دورًا في أمراض أخرى. المجهر الفلوري هو تقنية مباشرة لدراسات الخلايا الحية من العضيات ، ولكن هذه التقنية لديها قرار من > 200 نانومتر ، وهو أكبر من حجم النيوكليويدات الميتوكوندريا (~ 100 نانومتر9،10،11،12). وقد تم التحايل على هذا الحد من قبل ما يسمى “فائقة الدقة” تقنيات، مثل تحفيز استنفاد الانبعاثات (STED) والمجهر توطين جزيء واحد (SMLM)13،14. حتى الآن، تم تصوير النيوكليويدات الميتوكوندريا وغيرها من DNAs في الخلايا الحية عن طريق المجهر المباشر إعادة بناء بصري ستوكاستيك (dSTORM)15. لوحظت الهياكل الدقيقة شبه الميتوكوندريا مع مواقف ربط مع mtDNA من قبل STED في الخلايا الحية16. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنيات فائقة الدقة كثافة إضاءة عالية ، مما يسبب تأثيرات سامة ضوئية على الخلايا الحية17. ولذلك، مرور الوقت التصوير من النيوكليويدات الميتوكوندريا مع قرار وراء حد الحيود هو التحدي. لمعالجة هذا، استخدمنا فائقة الدقة المجهر الإضاءة منظم (SR-SIM)18. SIM يتطلب جرعة طاقة الإضاءة أقل بكثير من STED و SMLM19. وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من تقنيات STED وSMLM، SIM يسمح مباشرة متعددة الألوان ثلاثية الأبعاد (3D) التصوير، وأنه لا يتطلب خصائص الفيزياء الضوئية خاصة من الفلوروفوريات أو تكوين عازلة التصوير19.
الاستراتيجية التقليدية لتسمية النيوكليويدات الميتوكوندريا في الخلايا الحية هي وضع علامات الفلورسنت على بروتين النيوكليويد الميتوكوندريا ، مثل TFAM20. ومع ذلك، في كثير من الحالات، هذه الاستراتيجية غير مناسبة. وعلاوة على ذلك، الإفراط في التعبير عن البروتين الفلوري الموسومة TFAM تنتج قطعة أثرية خطيرة21. وضع العلامات على الحمض النووي مع الأصباغ العضوية له مزايا على البروتين الفلوري (FP) القائم على استراتيجية. الأصباغ العضوية خالية من القيود المتعلقة بوضع علامات FP: يمكن استخدامها لأي نوع من الخلايا أو الأنسجة ويمكن تطبيقها في أي وقت من التجربة. وقد تم الإبلاغ عن تصوير الخلايا الحية من النيوكليويدات الميتوكوندريا مع العديد من الأصباغ الملزمة للحمض النووي: DAPI22، SYBR الأخضر23، Vybrant DyeCycle24، وبيكوغرين15،25،26. عيب كبير من معظم الأصباغ الملزمة للحمض النووي لعلامات النوكلويد هو أنها تلطخ كل الحمض النووي داخل الخلية. استهداف صبغة فقط إلى الحمض النووي الميتوكوندريا أمر مرغوب فيه للغاية. لتحقيق ذلك، واختيار دقيق لصبغة تمتلك خصائص فيزيائية كيميائية مناسبة أمر ضروري. ومن المعروف أن الأصباغ الدهنية التي تمتلك شحنة إيجابية غير موضعية ، مثل rhodamine 123 ، تتراكم في الميتوكوندريا الحية ، والتي تحافظ على إمكاناتها السلبية للأغشية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تربط صبغة مثالية لعلامات محددة من النيوكليويدات الميتوكوندريا الحمض النووي مع تقارب عال وتنبعث منها الفلورسال الساطع على ربط الحمض النووي. وبالنظر إلى هذه المتطلبات، فإن بعض السماويين واعدة (على سبيل المثال، بيكوغرين)، ولكن الحمض النووي ملطخ بوفرة بهذه الأصباغ في وقت واحد مع الحمض النووي الميتوكوندريا15،25،26. يصف هذا البروتوكول وضع علامات محددة على النيوكليويدات الميتوكوندريا في الخلايا الحية مع صبغة سمين أخرى ، SYBR Gold (SG) ، وتتبع النيوكليويدات في الوقت الفاصل فوق الدقة مقاطع فيديو SIM. وعلاوة على ذلك، يمكن تصوير الخلايا الحية الملطخة بـ SG بأي نوع من المجهر الفلوري المقلوب (الكونستبك، قرص الغزل، epifluorescence، وما إلى ذلك) مناسبة للخلايا الحية ومجهزة بمصدر ضوء 488 نانومتر.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من المكونات الحاسمة للبروتوكول: لتحقيق وضع العلامات التفضيلية للحمض النووي الميتوكوندريا ، يجب أن يبقى تركيز صبغة الحمض النووي الملزمة أثناء الحضانة منخفضًا جدًا (على سبيل المثال ، تمييع 1:10000 من مخزون تجاري نموذجي) ، وينبغي أن يكون وقت الحضانة 30 دقيقة. يجب ألا يتجاوز وقت الحضا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفان بأسيفا أختار وأنجيليكا رامبولد (كل من معهد ماكس بلانك لعلم المناعة وعلم الوراثة اللاجينية) لتوفير خلايا هيلا.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
References
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
