시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링
Summary
이 프로토콜은 시판되는 DNA 젤 얼룩이 있는 미토콘드리아 핵종의 특정 라벨링, 초고해상도 구조조명 현미경(SR-SIM)에 의한 라이브 라벨링 세포의 타임랩스 시리즈 획득, 핵운동의 자동 추적을 설명합니다.
Abstract
미토콘드리아 핵형성은 단백질로 코팅된 미토콘드리아 DNA 분자에 의해 형성된 소형 입자입니다. 미토콘드리아 DNA는 tRNA, rRNAs 및 몇몇 필수 미토콘드리아 폴리펩티드를 인코딩합니다. 미토콘드리아 핵형성은 핵분열/융합 및 기타 형태학적 변화를 겪는 동적 미토콘드리아 네트워크 내에서 분열및 분배됩니다. 고해상도 라이브 형광 현미경 검사법은 핵신의 위치와 움직임을 특성화하는 간단한 기술입니다. 이 기술을 위해, 핵형성은 그들의 단백질 분대, 즉 전사 인자 a (TFAM)의 형광 태그를 통해 일반적으로 표지됩니다. 그러나 이 전략은 아티팩트(TFAM에 대해 보고됨)를 유발할 수 있는 형광 단백질 태그가 지정된 구성물의 과발현이 필요하며 많은 경우에 실현 가능하지 않습니다. 유기 DNA 결합 염료는 이러한 단점을 가지고 있지 않습니다. 그러나, 그(것)들은 항상 핵과 미토콘드리아 DNA 둘 다의 얼룩을 보여주기, 따라서 미토콘드리아 핵형성에 특이성이 결여됩니다. 이러한 염료의 물리 화학적 특성을 고려하여 핵산 젤 얼룩(SYBR Gold)을 선택하고 살아있는 세포에서 미토콘드리아 핵세포의 우대 라벨링을 달성했습니다. 염료의 특성, 특히 DNA에 결합시 높은 밝기는 초고해상도 구조 조명 이미지의 타임 시리즈를 사용하여 미토콘드리아 핵운동의 후속 정량화를 허용합니다.
Introduction
원형 16.5 kbp DNA 분자는 미토콘드리아의 유전 물질을 구성하며, 미토콘드리아 산화 인산화 복합체에 필요한 22 tRNAs, 2 rRNAs 및 13개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 미토콘드리아 DNA는 미토콘드리아 전사 인자 a(TFAM) 및 여러 다른 단백질에 결합하여 미토콘드리아 핵형성1,,2,,3,,4. 미토콘드리아 핵형성은 세포 주기 상, 스트레스 및 기타 요인에 따라 형태학적리모델링,핵분열 또는 융합동안 미토콘드리아네트워크의성분 들 간에 이동 및 재분배(Pernas et al.7). 또한, 미토콘드리아 핵소자의 움직임은, 전신 성 홍반성 루푸스 질환8에 연루되어 다른 질병에 역할을 할 수 있다. 형광 현미경 검사법은 세포기관의 살아있는 세포 연구를 위한 간단한 기술입니다, 그러나 기술은 미토콘드리아 핵형성의 크기보다는 더 큰 >200 nm의 해결책을 가지고 있습니다 (~100,nm9,,10,,12).12 이러한 한계는 자극방출고갈(STED) 및 단일 분자 국소화 현미경(SMLM)13,,14와같은 소위 “초고해상도” 기술에 의해 회피되었다. 지금까지, 미토콘드리아 핵소자 및 기타 DNA는 직접 적인 현미경(dSTORM)15에의해 살아있는 세포에서 영상화되었다. mtDNA와 상관관계가 있는 위치를 가진 미세한 서브-미토콘드리아 구조는 살아있는세포(16)에서STED에 의해 관찰되었다. 그러나, 이러한 초고해상도 기술은 살아있는 세포에 광독성 효과를 일으키는 높은 발광 강도를 필요로17. 따라서 회절 한계를 초과하는 해상도를 가진 미토콘드리아 핵종의 시간 경과 이미징은 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 초해상도 구조조명 현미경(SR-SIM)18을사용했습니다. SIM은 STED 및 SMLM19보다훨씬 낮은 조명 전력 용량을 필요로합니다. 더욱이, STED 및 SMLM 기술과는 달리, SIM은 간단한 다색 3차원(3D) 이미징을 허용하며, 형광단 또는 이미징 버퍼조성물(19)의특정 광물리적 특성을 필요로 하지 않는다.
살아있는 세포에서 미토콘드리아 핵을 표지하기 위한 종래의 전략은 TFAM20과같은 미토콘드리아 핵형 단백질의 형광 태깅이다. 그러나 대부분의 경우 이 전략은 적합하지 않습니다. 더욱이, 형광 단백질 태그가 붙은 TFAM의 과발현은 심각한아티팩트(21)를생성한다. 유기 염료로 DNA를 표지하는 것은 형광 단백질 (FP) 기반 전략에 비해 장점이 있습니다. 유기 염료는 FP 태깅과 관련된 제한이 없습니다 : 그들은 세포 또는 조직의 모든 유형에 사용할 수 있으며 실험의 모든 시점에서 적용 할 수 있습니다. 미토콘드리아 핵소자의 살아있는 세포 이미징은 여러 DNA 결합 염료로 보고되었다: DAPI22,SYBR 그린23,비브란트 염료사이클24,및 피코그린15,,25,,26. 핵염균 표지를 위한 대부분의 DNA 결합 염료의 실질적인 결점은 세포 내의 모든 DNA를 얼룩지게 한다는 것입니다. 미토콘드리아 DNA에전적으로 염료를 표적으로 하는 것은 매우 바람직합니다. 이를 달성하기 위해서는 적절한 물리 화학 적 특성을 지닌 염료를 신중하게 선택해야합니다. 로다민(123)과 같은 국소화된 양성전하를 보유한 친유성 염료는 살아있는 미토콘드리아에 축적되어 부정적인 막 전위를 보존하는 것으로 알려져 있다. 또한, 미토콘드리아 핵소자의 특정 라벨링을 위한 이상적인 염료는 높은 친화력으로 DNA를 결합하고 DNA 결합시 밝은 형광을 방출해야 한다. 이러한 요구 사항을 고려할 때, 특정 시아닌은 유망하지만(예를 들어, 피코그린), 핵 DNA는 미토콘드리아 DNA15,,25,,26과동시에 이들 염료에 의해 풍부하게 염색된다. 본 프로토콜은 다른 시아닌 염료, SYBR 골드 (SG) 및 시간 경과 슈퍼 해상도 SIM 비디오에서 핵의 추적과 라이브 세포에서 미토콘드리아 핵의 특정 라벨을 설명합니다. 더욱이, SG 염색된 살아있는 세포는 살아있는 세포에 적합한 모든 유형의 반전형광 현미경(공초점, 회전 디스크, 에피네시 등)에 의해 이미지화될 수 있으며 488 nm 광원을 갖추고 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜에는 몇 가지 중요한 구성 요소가 있습니다 : 미토콘드리아 DNA의 우선 라벨링을 얻으려면 배양 중에 DNA 결합 염료의 농도가 매우 낮게 유지되어야합니다 (예 : 일반적인 상용 재고의 1 :10,000 희석), 인큐베이션 시간은 30 분이어야합니다. 인큐베이션 시간은 1 h를 초과해서는 안됩니다. 다른 DNA 결합 염료는 낮은 농도에서 라벨링시 강한 신호를 생성할 만큼 충분히 밝지 않습니다.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 아시파 아크타르와 안젤리카 람볼드 (면역 생물학 및 후성 유전학에 대한 막스 플랑크 연구소 모두) HeLa 세포를 제공하기위한 인정.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
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