Her præsenterer vi en pålidelig, minimalt invasiv og omkostningseffektiv metode til at registrere og fortolke elektrokardiogrammer i levende bedøvet voksne zebrafish.
Elektrokardiogram bølgeformer af voksne Zebra og dem af mennesker er bemærkelsesværdigt ens. Disse elektrokardiogram ligheder øge værdien af Zebra ikke kun som en forskningsmodel for menneskelig kardiel Elektrofysiologi og myopatier, men også som en surrogat model i høj hastighed farmaceutisk screening for potentielle kardiotoksiniteter til mennesker, såsom QT-forlængelse. Som sådan, in vivo elektro kardiografi for voksne Zebra er et elektrisk fænotypebestemmelse værktøj, der er nødvendig, hvis ikke uundværlig, for tværsnits-eller langsgående in vivo elektrofysiologiske karakterisering. Men alt for ofte er manglen på en pålidelig, praktisk og omkostningseffektiv optagelsesmetode stadig en stor udfordring, der forhindrer, at dette in vivo-Diagnosticeringsværktøj bliver lettere tilgængeligt. Her beskriver vi en praktisk, ligetil tilgang til in vivo elektro kardiografi for voksne Zebra ved hjælp af en lav vedligeholdelse, omkostningseffektiv, og omfattende system, der giver ensartede, pålidelige optagelser. Vi illustrerer vores protokol ved hjælp af sunde voksne mandlige Zebra på 12-18 måneder af alder. Vi introducerer også en hurtig realtids fortolknings strategi for kvalitets validering for at sikre data nøjagtighed og robusthed tidligt i elektrokardiogram optagelsesprocessen.
Den Zebra (Danio rerio) hjerte er placeret anteroventrally til thorax hulrum mellem operculum og bryst girdles. Hjertet er omgivet temmelig løst inden for en sølvfarvet perikardia SAC. Anatomisk, den Zebra hjerte er forskellig fra de fire-Chambered menneskelige og andre pattedyr hjerter på grund af sin diminutiv skala (100-fold mindre end det menneskelige hjerte) og dens to-kammer ed struktur bestående af kun et atrium og en ventrikel. Ikke desto mindre er elektrokardiogram (EKG) bølgeformer og varigheden af QT-intervallet af begge arter er bemærkelsesværdigt ens (figur 1). Derfor, zebra er dukket op som en populær model for at studere menneskelige nedarvede arytmias1,2,3 og for high-gennemløb Drug screening af potentielle humane kardiotoksiniteter4,5 , såsom QT-forlængelse.
I den rutinemæssige evaluering af menneskelige hjertesygdomme, kroppen-overflade EKG er blevet den mest udbredte første-line ikke-invasiv diagnostisk værktøj siden sin opfindelse af Einthoven i 1903. I modsætning hertil, siden den første tilpasning af kroppen-overflade EKG optagelsesmetode for voksne Zebra i 20066 og flere modifikationer derefter7, denne teknik har været stort set utilgængelige for mange forskere på området på trods populariteten af denne dyremodel. For andre forskere, der optrådte in vivo EKG-forhør for voksne zebrafish, førte store variationer blandt operatørerne til inkonsistens i EKG-fund fra forskellige undersøgelser. Almindelige årsager omfatter besværlige og dyre specialiserede enheder og software, lavt signal-støj-forhold, og forvirring om elektrodeplacering, alle yderligere forværret af en ufuldstændig forståelse af den voksne Zebra EKG-funktioner og underliggende vævs mekanismer. I betragtning af, at in vivo EKG er det eneste diagnostiske værktøj til elektrisk fænotype levende zebrafish, der er et klart behov for en standardiseret metode til at forbedre følsomhed og specificitet, reproducerbarhed og tilgængelighed.
Her præsenterer vi en praktisk, pålidelig og valideret tilgang til registrering og fortolkning af Zebra in vivo elektrokardiogrammer (figur 2). Ved hjælp af et enkelt bipolært bly i frontal planet undersøgte vi ændringerne i EKG-bølgeformer og intervalvarigheder af levende bedøvet sund vildtype AB voksen zebrafish.
Ved optagelse in vivo EKG for voksne zebrafisk ved hjælp af en enkelt bly, som vi viste i denne undersøgelse, er der en række forbehold vedrørende kvaliteten og validiteten af EKG-optagelsen resultater. Først, ved at vælge de passende anæstesi og bestemme den minimale nødvendige anæstesi koncentration, dybde, og varighed, balance bedøvelsesmiddel kardiotoksiniteter mod det kritiske behov for at undertrykke motion artefakter og a priori beslutsomhed for en overlevelse vs. Terminal eksperimentel design. Kapitalisering på den synergistiske potens af en kombination af flere anæstetika fra forskellige lægemiddelklasser5,14 og paralytiske1,6 at sænke dosis af individuelle agenter5 eller administration en lav vedligeholdelsesdosis efter en højere induktionsdosis er typiske strategier. Men på trods af sin velkendte potentielle kardiorespiratoriske toksiciteter, herunder død8, tricain er stadig den mest udbredte, den bedste tilgængelige, og den eneste bedøvelsesmiddel godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) for Zebra Anæstesi. Tricain er blevet populært anvendt i EKG-optagelse af voksne Zebra enten som en enkelt agent eller i kombination med andre anæstetika eller paralytika.
For det andet kan bly placering nøjagtighed sikres i det mindste for sund normal Zebra ved hjælp af vores fire validerende kriterier for en normal voksen Zebra EKG. Af de fire validerende kriterier, som vi foreslår her, bekræfter de to sidste kriterier sammen den grundlæggende overensstemmelse mellem R-bølgen og T-bølgen i et normalt EKG på5,7og15. Denne R-og T-bølge konkordance er en fortuitøs, men kritisk, lighed mellem Zebra og human16,17 normal EKG, der bidrager til den kliniske relevans af Zebra Heart model som et surrogat for humant hjerte Elektrofysiologi. Flere godartede eller ondartede forhold kan dog medføre, at et af de fire validerende kriterier bortfalder. For eksempel, R og T bølge konkordance er tabt i Myokardie iskæmi7,15. Dette tab af R og T bølge konkordance i myokardieiskæmi er en anden slående lighed mellem Zebra og humant EKG, der bidrager til den kliniske relevans af den Zebra myokardieinfarkt model.
Endelig anbefaler vi en standardpraksis i EKG-analyse. Med fremkomsten af teknologi kan EKG-analyse software generere automatisk EKG-tolkning. Vi anbefaler dog på det kraftigste, at uddannede mennesker altid skal genfortolke og verificere alle ECGs baseret på det respektive kliniske scenario, der fører til EKG-optagelse. Rutinemæssig over-afhængighed udelukkende på automatisk fortolkning af en EKG-analyse software er tilrådeligt, især i nærværelse af almindelige normale EKG-varianter, kardielle patologier, eller suboptimale bly placering.
Denne undersøgelse fokuserer på den minimalt invasive metode til korte EKG optagelses sessioner. Men, hvis behovet opstår for Terminal langvarig EKG optagelse sessioner varige timer, ændringer er nødvendige for at give tilstrækkelig iltning, hydrering, og anæstesi ved kontinuerlig perfusion6.
Derudover skal signal-støj-forholdet forbedres med en af mindst tre måder. At vælge en kraftigere forstærker er ofte en bekostelig, hvis ikke upraktisk, mulighed. Åbning af perikardiet SAC for at reducere volumen lederen er en fornuftig, men invasiv tilgang, der er blevet vedtaget7. Strategisk bly placering at justere den ledende akse i en retning parallelt med den vigtigste hjerte akse (figur 4b) vil maksimere EKG-spændings signalerne, men kan kræve trial and error, især i fravær af pericardiotomi.
In vivo EKG forhør metode til voksne zebra, som vi præsenterede her, tilbyder fire store fordele. For det første kræver vores minimalt invasive tilgang kun elektrode indsættelse, men ingen fiske skala fjernelse eller thoracotomy-pericardiotomi. Derfor, ved at minimere smerten for fiskene, vores tilgang muliggør gentagne EKG forhør i longitudinale overlevelse undersøgelser. For det andet, når anæstetika tilstrækkeligt undertrykke fisk bevægelse, in vivo EKG-optagelse system i vores undersøgelse konsekvent giver et tilfredsstillende signal-til-støj-forhold med støj-fri rå signaler. For det tredje sikrer den kvalitets validering med fire kriterier, som vi foreslår her, data nøjagtighed og-robusthed tidligt i EKG-dataindsamlingen og minimerer operatør afhængige variationer. Endelig er det især vores sidste validerende kriterium (den normale T-bølge er oprejst), der er i overensstemmelse med R-bølgen og T-bølgen, et vigtigt menneskelignende træk ved zebra normal EKG (figur 1).
Der findes dog stadig fire store begrænsninger for den nuværende in vivo-EKG-metodologi for voksne Zebra af vores gruppe og andre.
For det første, manglen på emne samarbejde nødvendiggør behovet for anæstesi med sin begrænsende kardiorespiratoriske toksicitet konsekvenser. For in vivo-EKG-forhør, hvorimod humane patienter aldrig har behov for sedation, kræver Zebra altid anæstetika eller paralytika, som alle forårsager variable kardiorespiratoriske toksiciteter.
For det andet, behovet for at sikre den vedlagte EKG fører lidt hæver invasivitet af en ellers ikke-invasiv procedure. Der henviser til, at bly i kroppens overflade-EKG-optagelse af mennesker er fuldstændig ikke-invasiv, fordi elektroder overholder det humane epidermis, er blyplacering til in vivo-EKG-optagelse af Zebra mere invasiv, fordi stål elektroder som minimum skal punktere fiske huden for sikker indsættelse i fiskens muskulatur.
De sidste to begrænsninger stammer fra de anatomiske begrænsninger af Zebra brystet og hjertet. For det tredje, den minuscule størrelse af den voksne Zebra hjerte nødvendiggør en drastisk reduktion i antallet af EKG-ledninger. Mens mennesker let kan rumme tolv leads i en standard EKG-optagelse, vil voksne Zebra typisk kun kunne rumme en enkelt unipolær eller bipolar bly. Forgreningen af et enkelt EKG-bly er udfordringen med at optimere samtidig amplituder af alle tre P-, R-og T-bølger. Derfor kan det ikke overvurderes, hvor vigtig en optimal og præcis blyplacering i Zebra-EKG-forhør er. I zebrafish præsenterer T Wave en unik afsløring udfordring, fordi det er ofte den mindste af disse tre bølger. Derfor, den Zebra T bølge amplitude bør modtage optimering prioritet over de typisk større P og R bølger.
Fjerde, bestemmelse af Zebra vigtigste hjerte akse til at maksimere R bølge amplitude kan være udfordrende. Årsagen er, at Zebra Heart har mere bevægelsesfrihed inden for sin løse perikardiesac i forhold til det menneskelige hjerte i sin form-fitting handske-lignende periicardium.
Samlet set vil disse begrænsninger stimulere fremtidig metode innovation. Med fremkomsten af 3D-print og deformerbar elektronik18, er der håb for direkte bly implantation en dag i vågen, Alert, svømning Zebra ved hjælp af en “hjerte sok” af trådløse elektrode sensorer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health R01 HL141452 to TPN. ADInstruments har venligt givet generøse midler til at afholde omkostningerne ved åben adgang udgivelse, men havde ingen rolle i hverken eksperimentel design, dataindsamling, dataanalyse af denne undersøgelse eller nogen adgang til manuskriptet forud for offentliggørelsen.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |