从人类和小鼠心肌标本中分离巨噬细胞子集和细胞位细胞
Summary
这里介绍的一个协议，通过酶消化制备单个细胞悬浮液，从人类和小鼠心肌中分离出巨噬细胞和其他非免疫细胞的各种子集。提出了基于流细胞学的识别与分离巨噬细胞表征的门控方案。
Abstract
巨噬细胞代表了心脏中最异质和丰富的免疫细胞群，是心脏损伤后推动炎症和治疗反应的中心。巨噬细胞的各种子集如何协调心脏损伤后的免疫反应是一个活跃的研究领域。这里介绍的是一个简单的协议，我们的实验室执行常规，从小鼠和人类心肌标本从健康和患病个体提取巨噬细胞。简单地说，该协议涉及心脏组织的酶消化，以产生单个细胞悬浮液，然后是抗体染色和流动细胞测定。该技术适用于对已分拣的细胞进行的功能性检测以及散装和单细胞RNA测序。该协议的一个主要优点是其简单性、最小日常变化和广泛的适用性，允许研究各种小鼠模型和人类疾病实体的巨噬菌体异质性。
Introduction
巨噬细胞是心脏中最丰富的免疫细胞类型，在心脏损伤1、2、3、4后产生强健的炎症和复原反应方面起着重要作用。此前，我们小组确定了从不同发育起源5、6的鼠心中产生的两个主要巨噬细胞子集。从广义上讲，根据CCR2（C-C型化学受体2）的细胞表面表达，可以识别组织驻留心脏巨噬细胞子集的不同群体。CCR2–巨噬细胞（细胞表面表达：CCR2–MHCII低和CCR2–MHCII高）是胚胎起源（原始和红霉素血统），能够自我更新，并代表在静息条件下占主导地位的种群。居民CCR2–巨噬细胞具有明确的造血原源，通过从循环单核细胞招募来维持，并在静息条件下代表一个未成年人群。功能上，CCR2–巨噬细胞产生最小的炎症，对冠状动脉发育新生儿心脏再生5，7至关重要。相反，CCR2–巨噬细胞在心脏侮辱后启动强健的炎症反应，并造成辅助性心肌细胞损伤、左心室的不良重塑和心力衰竭进展8、9。
最近，我们已经表明，人类心肌还包含两个不同的巨噬细胞子集，被类似地识别为CCR2-或CCR2=8。基因表达和功能分析表明，人类CCR2–和CCR2+巨噬细胞代表功能不同的子集，在功能上类似于CCR2–和CCR2–在小鼠心脏中发现的巨噬细胞。人类CCR2–巨噬细胞表达生长因子的稳健水平，包括IGF1、PDGF、Cyr61和HB-EGF。CCR2–巨噬细胞在促进炎症的化学素和细胞因子中富集，如IL-1b、IL-6、CCL-2、CCL-7和TNF-a。刺激的CCR2–巨噬细胞分泌明显升高的炎症细胞因子白细胞因子-1+（IL-1+）在培养中。这些子集如何差异地促进组织修复和左心室 （LV） 在心脏损伤背景下的重塑仍然是一个积极研究的领域。
基于流细胞学对小鼠和人心脏的巨噬细胞异质性的分析需要消化心脏组织并产生单个细胞悬浮液，然后进行流式细胞测量分析或细胞分拣，以便进一步进行下游过程，如散装RNA测序/单细胞RNA测序或培养细胞进行功能化检测。纳伦多夫等人2007年10日首次报道了从鼠心中分离单个细胞悬浮的最初协议。我们的实验室已经调整和修改了协议，从人类心肌中提取巨噬细胞。使用相同的协议，但在染色和门控方案略有修改，CD45–从人类心肌的基质细胞也可以收获。这里介绍，在文本和视频中，是一个协议，这是例行执行从人类心肌提取巨噬细胞或基质。
心脏组织标本从成人患者扩张性心肌病（DCM：特发性或家族性）或缺血性心肌病（ICM）接受左心室辅助装置（LVAD）植入或心脏移植。在开始消化程序之前，被切除的心脏或LVAD核心在血管内注入冷盐水。需要注意的是，根据疤痕或脂肪组织渗透程度确定的组织标本的”质量”可以极大地影响巨噬细胞的产量。大面积疤痕的心脏标本的细胞产量会低得多，当所需的下游分析方法需要体外细胞培养时，可能会造成严重的技术限制。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议允许从人类心肌中提取各种巨噬菌体子集。该协议很简单，需要 3 到 4 小时准备单细胞悬浮液，为 FACS 分析做好准备。尽管该协议执行起来相对简单，但需要考虑某些技术方面，这将最大程度地降低可变性。首先，及时与人体组织合作是最佳细胞生存能力所必需的。保持组织在冷盐水/HBSS中，以尽量减少细胞死亡是很重要的。还需要从心肌标本中去除表皮脂肪和其他结缔组织。一致的组织?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目由华盛顿大学儿童探索研究所和圣路易斯儿童医院（CH-II-2015-462，CH-II-2017-628）、巴恩斯犹太医院基金会（8038-88）和NHLBI（R01）提供资金，使该项目得以实施。HL138466，R01 HL139714）。K.J.L.由NIH K08 HL123519和伯罗斯欢迎基金（1014782）提供支持。
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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