عزل مجموعات الضامة والخلايا اللحمية من الإنسان والماوس عينات عضله القلب
Summary
يقدم هنا بروتوكول لعزل مختلف المجموعات الفرعية من الضامة وغيرها من الخلايا غير المناعية من عضله الدم البشرية والماوس من خلال اعداد تعليق خليه واحده من خلال الهضم الانزيمي. وتعرض أيضا مخططات الصب لتحديد وتوصيف الضامة المعزولة علي أساس التدفق الخلوي.
Abstract
الضامة تمثل الأكثر تجانسا ووفره الخلايا المناعية السكان في القلب وهي مركزيه في القيادة التهاب والاستجابات التعويضية بعد أصابه القلب. كيف المجموعات الفرعية المختلفة من الضامة تنسق الاستجابات المناعية بعد أصابه القلب هي منطقه نشطه من البحوث. المقدمة هنا هو بروتوكول بسيط ان مختبرنا ينفذ بشكل روتيني ، لاستخراج الضامة من الفئران والعينات البشرية عضله العين التي تم الحصول عليها من الافراد الأصحاء والمريضة. باختصار ، ينطوي هذا البروتوكول علي الهضم الانزيمي لأنسجه القلب لتوليد تعليق خليه واحده ، تليها تلطيخ الأجسام المضادة ، وتدفق الخلايا الخلوية. هذه التقنية هي مناسبه لاختبارات وظيفية أجريت علي الخلايا فرزها ، فضلا عن الجزء الأكبر وخليه واحده التسلسل RNA. ومن المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هو بساطته ، الحد الأدنى من يوم إلى يوم الاختلاف وتطبيق واسعه تسمح التحقيق في تغاير الضام عبر مختلف نماذج الماوس والكيانات البشرية المرض.
Introduction
الضامة تمثل الأكثر وفره من نوع الخلايا المناعية في القلب ، وانها تلعب أدوارا هامه في توليد ردود الفعل التهابيه والتعويضية القوية بعد أصابه القلب1،2،3،4. في السابق ، حددت مجموعتنا مجموعتين رئيسيتين من الضامة في قلب murine مشتقه من أصول تنموية متميزة5،6. علي نطاق واسع ، يمكن تحديد السكان متميزة من الانسجه المقيمين القلب الضامة المجموعات الفرعية استنادا إلى التعبير سطح الخلية من CCR2 (C-C عزر المستقبلات chemokine 2). CCR2الضامة ( التعبير سطح الخلية: CCR2المنخفضة و CCR2–mhciiعاليه) هي من أصل جنيني (السلالات البدائية والحمرة) ، قادره علي التجديد الذاتي ، وتمثل السكان المهيمنة تحت ظروف التماثل المنزلي. CCR2المقيمين + الضامة هي من أصل نهائي الدم ، ويتم الحفاظ عليها من خلال التوظيف من الخلايا الاحاديه المتداولة ، وتمثل السكان القاصرين تحت ظروف التماثل المنزلي. وظيفيا ، CCR2الضامة توليد الحد الأدنى من التهابات وهي حاسمه للتنمية التاجية القلب الوليد التجديد5،7. في المقابل ،CCR2 + الضامة بدء استجابات التهابيه قويه بعد الإهانات القلبية والمساهمة في التبعية عضله الاصابه ، وأعاده عرض سلبيه من البطين الأيسر ، وفشل القلب التقدم8،9.
في الاونه الاخيره ، لقد أظهرنا ان عضله العين البشرية تحتوي أيضا علي مجموعتين فرعيتين متميزتين من الضامة التي تم تعريفها بالمثلاما CCR2 أو CCR2 +8. وكشفت التعبيرات الجينية والتحليلات الوظيفية ان الCCR2البشرية والCCR2 + الضامة تمثل مجموعات فرعيه متباعدة وظيفيا ومشابهه وظيفيالCCR2 والCCR2 + الضامة الموجودة في قلب الماوس. الإنسان CCR2الضامة التعبير عن مستويات قويه من عوامل النمو ، بما في ذلك IGF1 ، Pdgf ، Cyr61 ، و HB-egf. CCR2 + الضامة المخصب في مستقطبات والخلوية التي تعزز التهاب ، مثل il-1b ، آيل-6 ، سي سي-2 ، سي سي-7 ، و tnf-a. حفزCCR2 + الضامة تفرز مستويات اعلي بشكل ملحوظ من التهابات السايسيسين انترلوكين-1Β (IL-1β) في الثقافة. كيف تساهم هذه المجموعات الفرعية بشكل مختلف في إصلاح الانسجه وأعاده عرض البطين الأيسر (LV) في سياق أصابه القلب لا يزال مجالا للبحوث النشطة.
تحليل التدفق الخلوي القائم علي التجانس الضام في الماوس والقلب البشري يتطلب هضم انسجه القلب وتوليد تعليق خليه واحده تليها تحليل تدفق الخلوية أو فرز الخلايا لمزيد من العمليات المصب مثل التسلسل RNA السائبة/خليه واحده الجيش النيبالي التسلسلي التسلسل أو الخلايا لاختبارات وظيفية. البروتوكول الأصلي لاجراء تعليق خليه واحده من قلوب murine وأبلغت لأول مره من قبل مجموعه ناهريندورف في ناهريندورف وآخرون 200710. لدينا مختبر تكييف وتعديل البروتوكول لاستخراج الضامة من عضله العضل البشرية. باستخدام نفس البروتوكول ولكن مع تعديل طفيف في تلطيخ ومخطط النابضة ، ويمكن أيضا انتحصد الخلايا CD45 من عضله الام البشرية. يقدم هنا ، في النص والفيديو ، هو البروتوكول الذي يتم تنفيذه بشكل روتيني لاستخراج الضامة أو اللحمية من عضله الدم البشرية.
يتم الحصول علي عينات الانسجه القلبية من المرضي البالغين الذين يعانون من اعتلال عضله القلب المتوسع (DCM: مجهول الشخص أو العائلي) أو اعتلال العضلة الدماغية (ICM) الذي يخضع لعمليه غرس أو زرع القلب في جهاز مساعده البطين الأيسر (LVAD). القلوب المفسرة أو النوى LVAD هي إينترافاسكولارلي perfused مع المحلول الملحي البارد قبل بدء عمليه الهضم. من المهم ان نلاحظ ان “نوعيه” عينه من الانسجه التي تحدد من حيث درجه من تندب أو تسلل الانسجه الدهنية يمكن ان تؤثر بشكل كبير علي الغلة من الضامة. عينات القلب مع مساحات كبيره من تندب سيكون لها اقل بكثير من الغلة الخلية ويمكن ان تشكل القيود الفنية خطيره عند المطلوب أساليب التحليل المصب تتطلب في المختبر الخلية الخياطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول لاستخراج المجموعات الفرعية الضامة المختلفة من عضله الام البشرية. البروتوكول بسيط ويستغرق 3 إلى 4 ساعات لاعداد تعليق خليه واحده جاهزه للتحليل FACS. وعلي الرغم من ان تنفيذ البروتوكول بسيط نسبيا ، فان هناك بعض الجوانب التقنية التي يتعين النظر فيها والتي ستقلل من التغير إلى ادني…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تسني هذا المشروع من خلال التمويل المقدم من معهد اكتشاف الأطفال بجامعه واشنطن ومستشفي سانت لويس للأطفال (CH-II-2015-462 ، CH-II-2017-628) ، ومؤسسه بارنز-المستشفى اليهودي (8038-88) ، و NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. معتمد من قبل المعاهد القومية للصحة K08 HL123519 و Burخشونه صندوق الترحيب (1014782).
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
