여기서 제시된 프로토콜은 효소 소화를 통해 단일 세포 현탁액을 준비시킴으로써 인간 및 마우스 심근으로부터 대식세포 및 기타 비면역 세포의 다양한 서브세트를 분리하는 프로토콜이다. 유세포분석 기반 식별 및 절연 대식세포의 특성화를 위한 게이팅 방식도 제시된다.
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이 논문에서
요약
초록
대식세포는 심장에서 가장 이질적이고 풍부한 면역 세포 집단을 나타내며 심장 손상 후 염증 및 회복 반응을 유도하는 데 핵심적입니다. 어떻게 대식 세포의 다양 한 하위 집합 심장 부상 후 면역 반응을 조율 연구의 활성 영역. 여기에 제시된 간단한 프로토콜은 우리 실험실이 건강하고 병들인 개인에게서 얻은 마우스와 인간 심근 표본에서 대식세포의 추출을 위해 일상적으로 수행하는 간단한 프로토콜입니다. 간략하게, 이 프로토콜은 항체 염색, 및 유세포 측정에 선행된 단 하나 세포 현탁액을 생성하기 위하여 심장 조직의 효소 소화를 관련시킵니다. 이 기술은 대량 및 단세포 RNA 시퀀싱뿐만 아니라 정렬된 세포에서 수행되는 기능성 분석법에 적합합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 단순성, 최소한의 일일 변동 및 다양한 마우스 모델 및 인간 질병 개체에 대한 대식세포 이질성에 대한 조사를 허용하는 광범위한 적용성입니다.
서론
대식세포는 심장에서 가장 풍부한 면역세포 유형을 나타내며, 심장 손상1,2,3,4에이어 강력한 염증 및 회복 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 한다. 이전에, 우리 그룹은 뚜렷한 발달 기원5,6에서파생된 뮤린 심혼에 있는 대식세포의 2개의 중요한 부세트를 확인했습니다. 광범위하게, 조직 상주 심장 대식세포 서브세트의 뚜렷한 집단은 CCR2의 세포 표면 발현에 기초하여 확인될 수 있다(C-C 모티프 케모카인 수용체 2). CCR2- 대식세포(세포 표면 발현: CCR2- MHCII낮고 CCR2- MHCII높음)는배아 기원(원시및 적혈구 계보)이며, 자가 갱신할 수 있고, 동압 조건 하에서 지배적인 집단을 나타낸다. 상주 CCR2+ 대식세포는 확실한 조혈 기원이며, 순환 단핵구로부터의 모집을 통해 유지되며, 항상성 조건하에서 소집단을 나타낸다. 기능적....
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프로토콜
제시된 프로토콜은 세인트 루이스 기관 검토 위원회 (#201305086)에있는 워싱턴 대학에 의해 승인되었습니다. 모든 피험자는 샘플 수집 전에 정보에 입각한 동의를 제공하고 실험은 승인된 연구 프로토콜에 따라 수행됩니다. 제시된 프로토콜은 워싱턴 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인으로 수행되며 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드에 설명된 지침을 따릅니다.
1. 인간 심장 조직 표본의 준비
- 왼쪽 및 오른쪽 관상 동맥 오스티아를 캐뉼로 심은 심장을 씻어 내고 200 mL의 차가운 식염수로 주입하십시오.
- LVAD 에피카디얼 용기를 캐뉼링하여 LVAD 정점 코어티를 세척하고 50 mL의 차가운 식염수를 주입합니다.
- 멸균 가위를 사용하여 차가운 식염수 또는 HBSS에서 좌심실의 상피 또는 측면 벽으로부터 조직 시편을 해부합니다.
- 조심스럽게 미세 가위를 사용하여 표본에서 후두 지방과 chordae tendineae을 해부.
- 멸균 블레이드 또는 가위를 도움으로 약 200mg의 무게로 조직 덩어리를 해부하십시오.
2. 마우스 심장의 준비
- CO2 질식 또는....
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결과
기재된 프로토콜은 마우스와 인간 심근으로부터 대식세포의 분리를 허용한다. 동일한 프로토콜을 사용하지만, 다른 염색 및 게이팅 전략을 사용하여, 기질 세포는 또한 인간 심근으로부터 수확될 수 있다. 여기에 제시된 FACS 결과는 BD LSRII 또는 BD FACS ARIA III 플랫폼에서 획득되었습니다. 보정 제어는 스테인드 비장 세포에서 단일 색상 제어 샘플에서 생성되었다. 도 1은 처리되지 않은 인간 LVAD 코어를 나타낸다. 도 2는 CCR2-및 CCR2+인간 대식세포의 유동 선별을 위한 게이팅 방식을 나타낸다. 도3A는 CD45-인간 심근으로부터의 기질 세포및 도 3
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토론
이 프로토콜은 인간 심근으로부터 다양한 대식세포 서브세트를 추출할 수 있게 한다. 이 프로토콜은 간단하며 FACS 분석을 위해 준비된 단일 셀 현탁액을 준비하는 데 3~4시간이 걸립니다. 프로토콜은 수행하기가 비교적 간단하지만 가변성을 최소화할 수 있는 특정 기술적 측면을 고려해야 합니다. 첫째, 최적의 세포 생존을 위해 인간 조직과 적시에 작업하는 것이 필요합니다. 세포 사멸을 최소화하기 위해 조직을 차가운 식염수/HBSS에 보관하는 것이 중요합니다. 또한 심근 시편에서 상피 지방 및 기타 결합 조직을 제거해야합니다. 일관된 조직 다듬기 및 소화 시간은 샘플 변이에 대한 샘플을 감소시게 됩니다.
조직 소화 및 후속 세포 수율에 있는 intra 분석 및 교차 분석 가변성이 둘 다 있습니다. 이것은 조직에서 단 하나 세포 현탁액을 준비에 있는 제한의 한개입니다. 이를 최소화하는 가장 중요한 방법은 효소가 비교적 새롭고 적절하게 aliquoted되고 -80 °C에 저장되도록하는 것입.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 워싱턴 대학의 아동 발견 연구소와 세인트 루이스 아동 병원 (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), 반스 유대인 병원 재단 (8038-88), NHLBI (R01)에서 제공하는 기금으로 가능했습니다. HL138466, R01 HL139714). K.J.L.은 NIH K08 HL123519 및 버로우스 웰컴 펀드(1014782)의 지원을 받고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 코노칼 튜브 | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 &마이크로; m 세포 여과기 | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK 용해 버퍼 | Gibco | A10492-01 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A2058 | |
| 콜라겐 분해 효소 1 | 시그마 | C0130-1G | |
| DAPI | 써모 피셔 | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| 효소 비활성화 완충액 | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS 완충액 | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| 태아 소 혈청 | Gibco | A3840201 | |
| 집게 | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| 지혈제 | VWR | 63042-052 | |
| 히알루로니다아제 타입 1-s | 시그마 | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| 페트리 접시 | Thermo Fisher | ||
| 면도날 | VWR | 55411-050 | |
| 가위 | VWR | 82027-578 |
참고문헌
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814(2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electr....
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재인쇄 및 허가
