Isolering av macrophage delsett og stromal celler fra Human og Mouse hjerteinfarkt prøver
Summary
Presentert her er en protokoll for å isolere ulike delsett av makrofager og andre ikke-immune celler fra menneske og mus myokard ved å forberede en enkelt celle suspensjon gjennom enzymatisk fordøyelse. Gating ordninger for Flow flowcytometri basert identifisering og karakterisering av isolerte makrofager er også presentert.
Abstract
Makrofager representerer de mest heterogene og rikelig immun celle populasjoner i hjertet og er sentrale i kjøring betennelser og reparerende svar etter hjertestans skade. Hvordan ulike delsett av makrofager arrangerer immunresponsen etter hjertestans skade er et aktivt område av forskning. Presentert her er en enkel protokoll som vår Lab utfører rutinemessig, for ekstraksjon av makrofager fra mus og menneskelige myokard prøver Hentet fra friske og syke individer. Kort, innebærer denne protokollen enzymatisk fordøyelse av CARDIAC vev for å generere en enkelt celle suspensjon, etterfulgt av antistoff farging, og flyt flowcytometri. Denne teknikken er egnet for funksjonell analyser utført på sorterte celler, samt bulk og enkelt celle RNA sekvensering. En stor fordel med denne protokollen er dens enkelhet, minimal dag til dag variasjon og bred anvendelse tillater gransking av macrophage heterogenitet på tvers av ulike mus modeller og menneskelig sykdom enheter.
Introduction
Makrofager representerer den mest tallrike immun celletypen i hjertet, og de spiller viktige roller i å generere robuste inflammatoriske og reparerende svar etter CARDIAC skade1,2,3,4. Tidligere har gruppen vår identifisert to store delsett av makrofager i murine hjerte som er avledet fra forskjellige utviklingsmessige Origins5,6. Bredt, distinkte populasjoner av vev bosatt CARDIAC macrophage delsett kan identifiseres basert på celleoverflaten uttrykk for CCR2 (C-C motiv chemokine reseptor 2). CCR2– makrofager (celle overflate uttrykk: CCR2–MHCIIlav og CCR2–MHCIIhøy) er av embryonale opprinnelse (primitive og erythromyeloid linjene), i stand til å fornye seg selv, og representerer en dominerende befolkning under homøostatisk forhold. Resident CCR2+ makrofager er av definitive blodkreft opprinnelse, opprettholdes gjennom rekruttering av sirkulerende monocytter, og representerer en mindre befolkning under homøostatisk forhold. Funksjonelt, CCR2– makrofager generere minimal betennelse og er avgjørende for koronar utvikling nyfødt hjerte regenerering5,7. I kontrast CCR2+ makrofager initiere robuste inflammatoriske responser etter hjerte fornærmelser og bidra til sikkerhet cardiomyocyte skade, ugunstig remodeling av venstre ventrikkel, og hjertesvikt progresjon8,9.
Nylig har vi vist at den menneskelige myokard også inneholder to forskjellige delsett av makrofager identifisert på samme måte som enten CCR2– eller CCR2+8. Genuttrykk og funksjonelle analyser avslørte at humant CCR2– og CCR2+ makrofager representerer funksjonelt avvikende delsett og er funksjonelt analogt med CCR2– og CCR2+ makrofager funnet i muse hjertet. Human CCR2– makrofager uttrykker robuste nivåer av vekstfaktorer, inkludert IGF1, PDGF, CYR61 og HB-EGF. CCR2+ makrofager er beriket med chemokiner og cytokiner som fremmer betennelse, for eksempel Il-1B, Il-6, CCL-2, CCL-7 og TNF-a. Stimulert CCR2+ makrofager skiller markant høyere nivåer av inflammatorisk cytokin interleukin-1Β (Il-1β) i kulturen. Hvordan disse delsett differensielt bidra til vev reparasjon og venstre ventrikkel (LV) remodeling i sammenheng med CARDIAC skade er fortsatt et område av aktiv forskning.
Flow-flowcytometri basert analyse av macrophage heterogenitet i musen og menneskets hjerte krever fordøye CARDIAC vev og generere en enkelt celle suspensjon etterfulgt av flyt analytiske analyse eller celle sortering for videre nedstrøms prosesser som bulk RNA sekvensering/enkelt celle RNA sekvensering eller dyrking cellene for funksjonell analyser. Den opprinnelige protokollen for å lage en enkelt celle suspensjon fra murine hjerter ble først rapportert av Nahrendorf gruppe i Nahrendorf et al. 200710. Laboratoriet vårt har tilpasset og modifisert protokollen for å trekke ut makrofager fra den menneskelige myokard. Ved hjelp av samme protokoll, men med liten endring i farging og gating ordningen, kan CD45– stromal celler fra den menneskelige myokard også høstes. Presentert her, i tekst og video, er en protokoll som utføres rutinemessig for ekstraksjon av makrofager eller stromal fra den menneskelige myokard.
CARDIAC vevsprøver er innhentet fra voksne pasienter med utvidede kardiomyopati (DCM: idiopatisk eller familiær) eller iskemiske kardiomyopati (ICM) gjennomgår venstre ventrikkel hjelpeenhet (LVAD) implantation eller hjertestans transplantasjon. Eksplanterte hjerter eller LVAD kjerner er intravaskulært perfusert med kaldt saltvann før du starter fordøyelsen prosedyren. Det er viktig å merke seg at “kvalitet” av vev prøven bestemmes i form av grad av arrdannelse eller fettvev infiltrasjon kan i stor grad påvirke avkastningen av makrofager. Hjerte prøver med store områder av arrdannelse vil ha mye lavere celle utbytte og kan utgjøre alvorlig teknisk begrensning når ønsket nedstrøms analysemetoder krever in vitro celle dyrking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen gir mulighet for ekstraksjon av ulike macrophage delsett fra humant myokard. Protokollen er enkel og tar 3 til 4 timer for å forberede enkelt celle oppheng klar for FACS analyse. Selv om protokollen er relativt enkel å utføre, er det visse tekniske aspekter som må vurderes som vil minimere variasjon. For det første, arbeider i tide med menneskelig vev er nødvendig for optimal celle levedyktighet. Det er viktig å holde vevet i kaldt Saline/HBSS å minimere celle død. Det er også nødvendig å fjerne e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble gjort mulig ved finansiering gitt fra barnas Discovery Institute of Washington University og St. Louis Children ‘ s Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), stiftelsen av Barnes-jødiske Hospital (8038-88), og NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. er støttet av NIH K08 HL123519 og Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
