स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रसंस्करण भ्रूण, Eggshell, और कवक संस्कृति
Summary
यहाँ, हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) स्कैनिंग का उपयोग कर नाजुक ऊतक नमूने इमेजिंग के लिए विस्तृत प्रसंस्करण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। तीन अलग-अलग प्रसंस्करण विधियों, अर्थात्, हेक्सामेथिल disilazana (HMDS) रासायनिक सुखाने, सरल हवा सुखाने, और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने क्रमशः प्रारंभिक विकास चरणों में कठोर eggshells, भ्रूण, और कवक संस्कृतियों की तैयारी के लिए वर्णित हैं।
Abstract
यद्यपि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) व्यापक रूप से विभिन्न जैविक और गैर जैविक नमूनों के अल्ट्रा संरचनात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, विभिन्न जैविक नमूनों के प्रसंस्करण में शामिल तरीकों अद्वितीय प्रथाओं शामिल है. सभी पारंपरिक नमूनों प्रसंस्करण के लिए साहित्य में वर्णित प्रथाओं अभी भी उपयोगी अनुप्रयोगों मिल जाए, लेकिन नमूना तैयारी में सूक्ष्म परिवर्तन छवि गुणवत्ता को बदल सकते हैं, साथ ही, कलाकृतियों परिचय. इसलिए, विश्लेषण ऊतक के प्रकार के लिए विशिष्ट एक अद्वितीय नमूना तैयारी तकनीक का उपयोग करने के लिए ultrastructural संकल्प के साथ एक अच्छी गुणवत्ता की छवि प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इस अध्ययन का ध्यान इमेजिंग भ्रूण, कठोर eggshells, और SEM का उपयोग कवक संस्कृतियों के लिए इष्टतम नमूना तैयारी प्रोटोकॉल प्रदान करना है. निम्नलिखित अनुकूलन तीन विभिन्न नाजुक जैविक नमूने का अध्ययन के लिए अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए सिफारिश की गई थी. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड या 3% ग्लूटारैल्डिहाइड जैसे हल्के फिक्सेटिव्स का उपयोग, जिसके बाद इथेनॉल श्रृंखला के साथ निर्जलीकरण होता है, अनिवार्य है। स्लाइड संस्कृतियों द्वारा प्राप्त आगर ब्लॉक पर फफूंग mycelium agar प्लेटों से सीधे लिया संस्कृतियों की तुलना में एक बेहतर ultrastructural अखंडता पैदावार. HMDS के साथ भ्रूण के रासायनिक सुखाने महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की तुलना में सतह तनाव कलाकृतियों शुरू करने के बिना सुखाने प्रदान करता है। HMDS संकुचन की वजह से खुर रोकता है के रूप में नमूने सुखाने के दौरान कम भंगुर हैं. हालांकि, कवक संस्कृति के लिए, महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने रासायनिक सुखाने की तुलना में स्वीकार्य छवि गुणवत्ता प्रदान करता है। Eggshells बढ़ते से पहले पूरी तरह से धोने और हवा सुखाने के अलावा कोई विशेष तैयारी कदम के साथ छवि की जा सकती है. प्रत्येक परीक्षण के साथ प्राप्त स्वीकार्य छवि गुणवत्ता के आधार पर तैयारी के तरीके मानकीकृत किए गए थे।
Introduction
स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) ultrastructural विश्लेषण और intracellular इमेजिंग पूरक प्रकाश माइक्रोस्कोपी prokaryotes, पौधों, और जानवरों के तीन आयामी रूपरेखा के लिए. एक SEM के उच्च स्थानिक संकल्प यह सबसे बहुमुखी और शक्तिशाली तकनीकों में से एक नैनोमीटर पर नमूनों की सूक्ष्मसंरचनात्मक विशेषताओं की परीक्षा के लिए उपलब्ध बनाता है. Desicated नमूनों गहन विस्तार के साथ compositional और स्थलाकृतिक संरचनाओं के लिए हल कर रहे हैं, जो कार्यात्मक संबंधों के बारे में वैध निष्कर्ष विकसित करने के लिए नींव प्रदान करता है1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.जैविक नमूनों के SEM छवियों की व्याख्या करते समय, यह एक बड़ी चुनौती है कि प्रसंस्करण के दौरान बनाई गई हैं देशी संरचनाओं और कलाकृतियों के बीच अंतर है. एसईएम का प्रचलन सामान्यतः बहुत उच्च निर्वातों में किया जाता है ताकि नमूने10,11से उत्सर्जित प्राथमिक, द्वितीयक अथवा पश्च-अपस्थाक इलेक्ट्रॉन बीमों को प्रभावित करने वाले गैस अणुओं के किसी भी प्रकार के हस्तक्षेप से बचा जा सके . इसके अलावा, जैविक सामग्री उनके गरीब या गैर संचालन गुणों के कारण विकिरण क्षति के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। SEM में लोड किए गए नमूनों के लिए यह आवश्यक है कि वे किसी भी जैविक संदूषक से पूरी तरह शुष्क और मुक्त हों ताकि उच्च निर्वातवातावरणमें किसी भी संभव बाहरी वातावरण को समाप्त किया जा सके. चूंकि जैविक नमूनों में ज्यादातर पानी से बने होते हैं, इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त तैयारी तकनीकों की आवश्यकता होती है कि देशी संरचनाओं को बनाए रखा जाए।
प्राप्त संकल्प नमूना प्रकार और उपयोग किए गए वाद्य मापदंडों के लिए विशिष्ट तैयारी विधियों के अनुकूलन पर आधारित है। इस प्रकार, सभी ऊतक प्रकार के लिए सामान्यीकृत प्रसंस्करण चरणों का उपयोग करने से बचने के लिए आवश्यक है। कुछ जैविक नमूनों को उनकी संरचना को संरक्षित करने के लिए कम कड़े प्रसंस्करण की आवश्यकता होगी, जबकि कम समय और देखभाल के लिए नमूनों के नाजुक प्रकार के लिए आवश्यक हो सकता है सुखाने कलाकृतियों की शुरूआत से बचने के लिए, इस तरह के संकुचन और पतन के रूप में. नमूना तैयारी SEM इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण कदम है; रूपमितीय अध्ययनों के निष्कर्ष नमूना तैयारी प्रक्रिया12,13से उल्लेखनीय रूप से प्रभावित होते हैं . कई जैविक नमूनों के लिए आम तैयारी कदम निर्धारण, निर्जलीकरण और इस तरह के सोने, प्लेटिनम या पैलेडियम के रूप में एक धातु के साथ कोटिंग कर रहे हैं उनकी सतहों को परिवर्तित करने के लिए SEM विश्लेषण के लिए प्रवाहकीय हो. प्रकृति और इस्तेमाल किया कदम के संयोजन ऊतक के प्रकार के आधार पर अलग अलग होंगे, और अध्ययन के विशिष्ट लक्ष्यों. चार्ज बिल्ड-अप, वैक्यूम और इलेक्ट्रॉन बीम क्षति के प्रति संवेदनशीलता नरम नाजुक जैविक नमूनों को संसाधित करते समय समस्याएं पैदा करती है, वस्तु की मूल संरचना को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त प्रसंस्करण चरणों की आवश्यकता होती है। ऑस्मियम टेट्रक्साइड फिक्सिंग, और निर्जलीकरण जैसे पारंपरिक तरीकों का उपयोग करने से संकुचन होता है और नाजुक ऊतकों का पतन14,15,16,17होता है . अध्ययन का उद्देश्य तैयार करने और छवि नरम नाजुक ऊतकों (जैसे, सरीसृप भ्रूण, चित्रित कछुए के अंडे, और कवक संस्कृतियों) के साथ पहले के अध्ययनों से विचारों के संयोजन के द्वारा व्युत्पन्न सुरुचिपूर्ण तरीके स्थापित करने के लिए है।
एक उपयुक्त फिक्सिंग विधि का चयन जैविक नमूनों के सूक्ष्म विश्लेषण के लिए पहला सबसे महत्वपूर्ण कदम है. किसी जीव से अलग होने के तुरंत बाद ऊतकों को ठीक करना अपघटन के कारण उनकी आकृति विज्ञान में परिवर्तन को रोकने के लिए आवश्यक है। एक प्रभावी fixative जल्दी से कोशिकाओं permeating द्वारा सेलुलर प्रक्रियाओं को समाप्त करना चाहिए और SEM17 के तहत दोनों बाद प्रसंस्करण कदम और परीक्षा का सामना करने के लिए नमूना की संरचना को स्थिर करने के लिए अपरिवर्तनीय प्रभाव को बनाए रखने , 18.यद्यपि कई रासायनिक और भौतिक निर्धारण विधियों को जाना जाता है, फिर भी रासायनिक निर्धारण का प्रयोग जैविक नमूनों के लिए अधिक सामान्यतः किया जाता है ताकि स्वविश्लेषण, putrefaction, और सुखाने के प्रभावके किसी भी सेल्यूलर परिवर्तन से बचा जा सके. साहित्य17,19,20,21 ,22,23 ,23, स्थिरीकरण में चर्चा की गई अनेक स्थिर रासायनिक योगों की चर्चा की गई है जो निराकरण द्वारा कार्य करते हैं और जैविक स्थूल अणुओं को एकत्रित करना, और जो सहसंयोजक रूप से परस्पर जोड़ने वाले स्थूल अणुओं द्वारा ठीक होते हैं। अल्कोहल का उपयोग डेनेटिंग फिक्सेटिव्स के रूप में किया जाता है जो अल्ट्रास्ट्रक्चर को बहुत खराब संरक्षित करते हैं और ज्यादातर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग किए जाते हैं और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण के लिए अनुशंसित नहीं होते हैं। क्रॉस-लिंकिंग फिक्सेटिव्स जैसे फॉर्मेल्डिहाइड, ग्लूटारैल्डिहाइड, और ऑस्मियम टेट्रऑक्साइड ऊतकों के भीतर मैक्रो अणुओं के बीच अंतर-अणुऔर अंतरा-अणुकारी का निर्माण करते हैं, जो अल्ट्रा-संरचनाओं के उत्कृष्ट संरक्षण प्रदान करतेहैं 11 ,24,25,26. जैविक नमूने तापमान के प्रति संवेदनशील होते हैं। निर्धारण की शुरुआत में तापमान को झिल्ली प्रोटीन की पार्श्व गतिशीलता को कम करने, अंतरकोशिकीय अणुओं के प्रसार को धीमा करने, और निर्धारणकीदर को धीमा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस होने की सिफारिश की जाती है। ऊतकों को ठीक करने के लिए आवश्यक समय काफी हद तक नमूने के आकार और उस गति पर निर्भर करता है जिस पर स्थिर विसरण और नमूना के घटकों के साथ प्रतिक्रिया करता है। पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड या 3% ग्लूटारैल्डिहाइड में एक रात भर निर्धारण उनके अनुक्रमिक पीनेटिव गुणों के लिए इस अध्ययन में उपयोग किए गए नमूनों के SEM विश्लेषण के लिए पसंदीदा तरीका है, जो छोटे नाजुक नमूनों को संसाधित करने की अनुमति देता है17 , 18 , 19 , 20 , 27. ऑस्मियम टेट्रेक्साइड के साथ एक पोस्ट-फिक्सेशन चरण न केवल अपनी विषाक्त प्रकृति के कारण समाप्त हो जाता है बल्कि इस अध्ययन में विश्लेषण किए गए नमूनों के लिए छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए कोई अतिरिक्त लाभ को लागू करने के लिए भी पाया जाता है।
जैविक नमूनों में तरल पदार्थ होते हैं जो SEM ऑपरेशन में हस्तक्षेप करते हैं; इसलिए, नमूने SEM नमूना कक्ष में डालने से पहले सूखे की जरूरत है. निर्जलीकरण सुनिश्चित किया जाता है, विलायक सतह तनाव के कारण नमूनों में कलाकृतियों बनाने के बिना ऊतक से हटा दिया जाना चाहिए / SEM इमेजिंग के लिए प्रसंस्करण ऊतकों के दौरान आमतौर पर तीन अलग अलग सुखाने तरीकों का इस्तेमाल किया गया: हवा सुखाने, महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने , और फ्रीज सुखाने के नमूने28,29,30,31. कुछ अध्ययनों से पता चलता है कितीनों सुखाने के तरीकों से पशुओं के ऊतकों के नमूनों के साथ समान परिणाम प्राप्त होते हैं 28 ,29,30,31. छोटे नमूनों के लिए उपयोग किया जाने वाला एक सामान्य अभ्यास अल्कोहल और हेक्सामेथिलडिस्लैज़ान (एचएमडीएस) की सांद्रता श्रृंखला को आरोही करके रासायनिक निर्जलीकरण है, लेकिन बड़े नमूनों को एक महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने (सीपीडी) उपकरण32का उपयोग करके सूखे जाते हैं। सुखाने की प्रक्रिया के दौरान, छोटे गुहाओं में बनने वाले काफी बल जो नमूने के माध्यम से तरल/गैस अंतराफलक द्वारा पारित किए जाते हैं; इससे खोखलेसंरचनाओंका पूर्ण पतन भी हो सकता है . उपचार के कारण होने वाली किसी भी विरूपण तो नमूना के एक देशी संरचनात्मक सुविधा के रूप में गलत हो सकता है. इस प्रकार, प्रसंस्करण के लिए सामान्यीकृत घटना समाप्त किया जाना चाहिए और एक अद्वितीय सुखाने की प्रक्रिया ऊतक के प्रत्येक प्रकार के लिए मानकीकृत किया जाना चाहिए, खासकर जब नाजुक ऊतक नमूनों का विश्लेषण कर रहे हैं.
उपर्युक्त सभी प्रक्रियाओं के विभिन्न संयोजन का उपयोग करके किए गए कई परीक्षणों में, हमने उन विधियों को मानकीकृत किया है जिनका उपयोग तीन नाजुक ऊतकों के SEM विश्लेषण के लिए किया जा सकता है: सरीसृप भ्रूण, चित्रित कछुओं के एगशेल्स, और कवक संस्कृतियों। विकासात्मक जीवविज्ञानी और आकृति विज्ञानी प्रतिनिधि कशेरुकी पशुओं में भ्रूण के विकास के दौरान सामान्य और असामान्य रूपजनन का वर्णन करते हैं। जीन संकेतन पथ ों पर जांच उपन्यास संरचनाओं के रूपात्मक वर्णन पर निर्भर करती है। SEM विश्लेषण के दौरान कशेरुकी भ्रूण संरचना में किसी भी अचानक परिवर्तन से बचने के लिए, हम निर्जलीकरण के बाद रासायनिक सुखाने की सलाह देते हैं। रासायनिक सुखाने HMDS का उपयोग अपेक्षाकृत नवीनतम सुखाने विधि है और लाभ रिश्तेदार तीव्रता, उपयोग में आसानी, लागत खो दिया है, और सीमित विशेषज्ञता और उपकरण9की जरूरत शामिल है। सीपीडी एक विशिष्ट तापमान और दबाव पर नमूनों भर में सीओ2 passaging का उपयोग कर एक आमतौर पर इस्तेमाल किया सुखाने तकनीक है। हमने पहचान की है कि HMDS नरम नाजुक ऊतकों सुखाने के लिए उपयुक्त है और बड़े नमूने महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की तुलना में संसाधित किया जा करने के लिए अनुमति देता है, जो भ्रूण ऊतकों के लिए व्यापक विरूपण का कारण बना. कवक34की आकृतिक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए SEM इमेजिंग के लिए नमूने तैयार करने के लिए अनेक विधियों का उपयोग किया गया है . कवक नमूनों आमतौर पर ओस्मियम tetroxide में इथेनॉल निर्जलीकरण और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के बाद तय कर रहे हैं, जो संतोषजनक परिणाम प्रदान कर सकते हैं, हालांकि osmium tetroxide के विषाक्त प्रभाव6,7,35 और कवक सामग्री खोने जबकि प्रसंस्करण के दौरान समाधान बदलने स्पष्ट नुकसान कर रहे हैं. निर्धारण के बिना हवा सुखाने का उपयोग कर नमूना तैयारी तकनीक भी36 अभ्यास किया गया है, लेकिन सिकुड़ और ढह संरचनाओं में परिणाम है, और इस तरह के नमूनों के अवलोकन आसानी से प्रजातियों की विशेषता है, जबकि गलत अर्थ लगाया जा सकता है। कवक हायफा तरल पदार्थ के संपर्क में अपनी अखंडता खो देता है और संरचना को बहाल करने के लिए एक भी सुखाने हासिल नहीं किया जा सकता है। इस प्रभाव के कारण, फ्रीज-ड्राइंग आमतौर पर फंगल माइसीलियम जैसे नरम ऊतकों को सुखाने के लिए प्रयोग किया जाता है। फ्रीज सुखाने साफ सामग्री के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन किसी भी लवण या स्राव की उपस्थिति सतह विस्तार है कि केवल SEM देखने के चरण में पहचान की जाएगी अस्पष्ट होगा. हमने ग्लूटारैल्डिहाइड फिक्सिंग और क्रिटिकल पॉइंट सुखाने के साथ स्लाइड कल्चर विधि को युग्मित किया ताकि बरकरार फंगल हाइफे और बीजाणुओं के संरचनात्मक विवरण प्राप्त किए जा सकें। हालांकि सीपीडी सुखाने भ्रूण में संकुचन का कारण बना, यह अच्छी तरह से संरक्षित mycelial संरचनाओं में हुई जब glutaraldehyde निर्धारण के साथ युग्मित. अंडकोश न केवल एक सुरक्षात्मक आवरण के रूप में कार्य करके, बल्कि यांत्रिक स्थिरता, गैस और पानी के पारगम्यता, और विकासशील भ्रूण के लिए कैल्शियम आरक्षित प्रदान करके अंडप्रस पशुओं के भ्रूण के लिए प्राथमिक महत्व का है। मीठे पानी के कछुए eggshells के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं “rigid” उनकी संरचना के आधार पर, और उनकी उपलब्धता के कारण जीवविज्ञानियों से महत्वपूर्ण ध्यान प्राप्त हुआ है1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
हम किसी भी कठोर एग्शेल प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है कि चित्रित कछुआ के अंडकोश और खोल झिल्ली की आसान परीक्षा के लिए सरल तरीकों का विस्तार। तैयारी के तरीके जिसके परिणामस्वरूप छवि गुणवत्ता और कम संभावित कलाकृतियों के आधार पर मूल्यांकन किया गया.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे अध्ययन में, अलग निर्धारण एजेंटों, निर्जलीकरण और सुखाने के तरीकों SEM इमेजिंग के लिए तीन अलग नाजुक जैविक नमूने तैयार करने के लिए परीक्षण किया गया: भ्रूण, eggshells, और कवक संस्कृतियों. SEM आमतौर पर सतह विश्ले?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ों यन् द्र डेनियल बाल्डासारे, सुनी ओसवेगो को पांडुलिपि पर सहायक विचार-विमर्श और टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे। इस अध्ययन चावल क्रीक एसोसिएट अनुदान, Oswego द्वारा समर्थित किया गया था; चैलेंज अनुदान SUNY Oswego और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) PGL और JG के लिए लघु अनुदान.
Materials
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
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