Behandling af embryoer, æggeskaller og svampe kultur til scanning af elektronmikroskopi

Summary

Her præsenterer vi detaljerede forarbejdnings protokoller for billeddannelse delikate vævsprøver ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). Tre forskellige forarbejdningsmetoder, nemlig disilazan disilazana (HMDS) kemisk tørring, enkel lufttørring, og kritisk punkt tørring er beskrevet for at forberede stive æggeskaller, embryoner på tidlige udviklingsmæssige stadier, og svampekulturer henholdsvis.

Abstract

Selv om scanning elektronmikroskopi (SEM) er ved at blive udbredt til den ultra-strukturelle analyse af forskellige biologiske og ikke-biologiske prøver, metoder, der er involveret i behandling af forskellige biologiske prøver involverer unikke praksis. Alle konventionelle praksisser beskrevet i litteraturen til behandling af prøver stadig finde nyttige applikationer, men subtile ændringer i prøven forberedelse kan ændre billedkvalitet, samt, indføre artefakter. Derfor, ved hjælp af en unik prøveforberedelse teknik specifikt for den type væv analyseret er nødvendig for at opnå en god kvalitet billede med ultrastrukturel opløsning. Fokus i denne undersøgelse er at give den optimale prøveforberedelse protokoller for billeddannelse embryoner, stive æggeskaller, og svampe kulturer ved hjælp af SEM. Følgende optimeringer blev anbefalet for at give gode resultater for de tre forskellige delikate biologiske prøver undersøgt. Brug af mildere fikser som 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd efterfulgt af dehydrering med ethanol-serien er obligatorisk. Svampemycelium på agar blokke opnået ved slide kulturer giver en bedre ultrastrukturel integritet i forhold til kulturer taget direkte fra agar plader. Kemisk tørring af embryoner med HMDS giver tørring uden at indføre overflade spændings artefakter sammenlignet med kritisk punkt tørring. HMDS forebygger revner forårsaget af krympning, da prøverne er mindre skrøbelige under tørring. Men for svampe kulturen giver kritisk punkt tørring acceptabel billedkvalitet sammenlignet med kemisk tørring. Æggeskaller kan imældes uden særlige forberedelsestrin, bortset fra grundig vask og lufttørring før montering. Præparationsmetoder blev standardiseret baseret på acceptabel billedkvalitet opnået ved hvert forsøg.

Introduction

Scanning elektronmikroskop (SEM) ultrastrukturel analyse og intracellulære Imaging supplement lys mikroskopi for tredimensionelle profilering af prokaryoter, planter, og dyr. Den høje rumlige opløsning af en SEM gør det til en af de mest alsidige og kraftfulde teknikker til rådighed til undersøgelse af mikrostrukturelle egenskaber af prøver på nanometer til mikrometer skala. Udtørrede prøver er løst til kompositoriske og topografiske strukturer med intense detaljer, som giver grundlaget for at udvikle gyldige konklusioner om funktionelle relationer^{1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. ved tolkning af SEM-billeder af biologiske prøver er det en stor udfordring at skelne mellem indfødte strukturer og de artefakter, der oprettes under forarbejdningen. SEM drives normalt ved meget høje støvsugere for at undgå interferens fra gasmolekyler, der påvirker de primære, sekundære eller sensorer elektronstråler, der udsendes fra prøve^10,11. Også, biologiske materialer er modtagelige for stråling skader på grund af deres dårlige eller ikke-ledende egenskaber. Det er vigtigt for de enheder indlæst i SEM at være helt tør og fri for organiske forurenende stoffer for at eliminere enhver mulig udgasning i en høj vakuum miljø^10,11. Da biologiske prøver for det meste består af vand, er der behov for yderligere tilberednings teknikker for at sikre, at de indfødte strukturer bevares.

Den opnåede opløsning er baseret på optimering af tilberedningsmetoder, der er specifikke for modeltyper og anvendte instrumentelle parametre. Således, det er nødvendigt at undgå at bruge generelle forarbejdningstrin for alle vævstyper. Nogle biologiske prøver vil kræve mindre strenge behandling for at bevare deres struktur, mens mere tid og pleje kan være nødvendig for sarte typer af prøver for at undgå indførelse af tørring artefakter, såsom svind og kollaps. Prøveforberedelse er et kritisk skridt i SEM Imaging; resultaterne af morpreuometriske undersøgelser er bemærkelsesværdigt påvirket af prøvens forberedelsesprocedure^12,13. Almindelige tilberednings trin for mange biologiske prøver er fiksering, udtørring og belægning med et metal som guld, platin eller Palladium for at omdanne deres overflader til at være ledende for SEM-analyse. Karakteren og kombinationen af de anvendte trin vil variere afhængigt af vævstype og de specifikke mål for undersøgelsen. Opladning ophobning, følsomhed over for vakuum og elektronstråle skader udgør problemer ved behandling af bløde sarte biologiske prøver, nødvendiggør yderligere behandling skridt til at bevare den oprindelige struktur af objektet. Ved hjælp af konventionelle metoder såsom osmium dinitrogentetraoxid fastsættelse, og dehydrering forårsage svind og sammenbrud af sarte væv^14,15,16,17. Formålet med undersøgelsen er at etablere elegante metoder, der er afledt ved at kombinere ideer fra tidligere undersøgelser med modifikationer til at forberede og billede bløde sarte væv (f. eks, krybdyr embryoner, æggeskal af malede skildpadder, og svampekulturer).

Udvælgelse af en passende fastgørelsesmetode er det første vigtigste skridt for mikroskopisk analyse af biologiske prøver. Fastgørelse af vævet umiddelbart efter isolering fra en organisme er afgørende for at forhindre ændringer i deres morfologi på grund af nedbrydning. En effektiv fikserende bør opsige cellulære processer ved at gennemtrænge cellerne hurtigt og opretholde virkningen irreversibelt at stabilisere strukturen af prøven til at modstå både efterfølgende forarbejdningstrin og undersøgelse under SEM^{17 , 18}. selv om flere kemiske og fysiske fikserings metoder er kendt, er kemisk fiksering mere almindeligt anvendt til biologiske prøver for at undgå cellulære ændringer som følge af autolyse, forrådnelse og tørre effekter. Der er talrige fiksativ kemiske formuleringer diskuteret i litteratur^{17,19,20,21,22,23}, fikater, at arbejde ved denaturering og koagulerende biologiske makromolekyler, og dem, der fastsættes ved kovalent tværgående makromolekyler. Alkoholer anvendes som denatureringsmidler, der bevarer ultrastruktur meget dårligt og bruges mest til let mikroskopi og anbefales ikke til elektron mikroskopisk analyse. Tværbindende fikser som formaldehyd, glutaraldehyd og osmium tetroxid skaber intermolekylære og intramolekoleculære tværbindende mellem makromolekyler i vævene, hvilket giver fremragende bevaring af ultra-strukturer^{11 ,24,25,26}. Biologiske prøver er følsomme over for temperatur. Temperaturen i begyndelsen af fiksering anbefales at være 4 °C for at reducere den laterale mobilitet af membran proteiner, at bremse udbredelsen af intercellulære molekyler, og at bremse satsen for fiksering¹¹. Den tid, der kræves til fastgørelse af væv, afhænger i høj grad af prøvens størrelse og den hastighed, hvormed fikserings formen diffuserer og reagerer med komponenterne i prøven. En overnatning fiksering i 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd i PBS ved 4 °c er den foretrukne metode til SEM analyse af enheder, der anvendes i dette studie for deres sekventielle penetrerende egenskaber, som tillader mindre delikate prøver, der skal behandles^{17 , 18 , 19 , 20 , 27}. et trin efter fiksering med osmium dinitrogentetraoxid elimineres ikke kun på grund af dets toksiske karakter, men det konstateredes også, at der ikke var nogen ekstra fordel ved at forbedre billedkvaliteten for de prøver, der blev analyseret i dette studie.

Biologiske prøver indeholder væsker, der forstyrrer SEM-operationen; Derfor skal prøverne tørres, før de indsættes i SEM prøvekammeret. Når dehydrering er sikret, skal opløsningsmidlet fjernes fra vævet uden at skabe artefakter i prøverne på grund af overfladespændingen/tørring. Tre forskellige tørre metoder blev almindeligt anvendt under behandling af væv til SEM Imaging: lufttørring, kritisk punkt tørring, og frysetørring prøver^28,29,30,31. Få undersøgelser rapporterer alle tre tørring metoder producerer identiske resultater med animalske vævsprøver^28,29,30,31. En generel praksis, der anvendes til mindre prøver, er kemisk dehydrering ved stigende koncentrationsserier af alkohol og hexamethyldisilazan (HMDS), men større prøver tørres ved hjælp af et kritisk punkt tørring (CPD) instrument³². Under tørringsprocessen, betydelige kræfter dannet i små hulrum, der passerer gennem prøven ved en væske/gas grænseflade; Dette kan endda føre til et fuldstændigt sammenbrud af de hule strukturer³³. Enhver deformation, der opstår på grund af behandlingen, kan derefter forveksles som en naturlig strukturel egenskab ved præparatet. Således bør det generaliserede fænomen til forarbejdning elimineres, og en unik tørring proces bør være standardiseret for hver type væv, især når sarte væv prøver analyseres.

I flere forsøg udført ved hjælp af forskellige kombinationer af alle de ovennævnte processer, vi standardiseret de metoder, der kan bruges til SEM analyse af tre sarte væv: krybdyr embryoner, æggeskaller af malede skildpadder, og svampe kulturer. Udviklingsmæssige biologer og morfologer beskriver normal og unormal morfogenese under embryo udvikling i repræsentative hvirveldyr. Undersøgelser af gensignalerings veje afhænger af den morfologiske beskrivelse af nye strukturer. For at undgå pludselige ændringer i hvirveldyr embryo struktur under SEM analyse, anbefaler vi kemisk tørring efter dehydrering. Kemisk tørring ved hjælp af HMDS er den relativt nyeste tørring metode og fordelene omfatter relativ hurtighed, brugervenlighed, tabte omkostninger, og den begrænsede ekspertise og udstyr behov⁹. CPD er en almindeligt anvendt tørring teknik ved hjælp af passaging CO₂ på tværs af prøverne ved en bestemt temperatur og tryk. Vi identificerede, at HMDS er egnet til tørring af blødt sarte væv og gør det muligt at behandle større prøver sammenlignet med kritisk punkt tørring, hvilket forårsagede omfattende deformation af embryonale væv. Flere metoder er blevet brugt til at forberede prøver til SEM Imaging til at studere morfologiske egenskaber af svampe³⁴. Svampe prøver er almindeligvis fastgjort i osmium dinitrogentetraoxid efterfulgt af ethanol dehydrering og kritisk punkt tørring, som kan give tilfredsstillende resultater, selv om de toksiske virkninger af osmium dinitrogentetraoxid^6,7,35 og miste svampemidler, mens skiftende løsninger under behandlingen er udtalt ulemper. Prøve forberedelses teknikken ved hjælp af lufttørring uden fiksering er også blevet praktiseret³⁶ men resulterer i skrumpet og kollapsede strukturer, og observation af sådanne prøver kan let misfortolkes, mens karakterisere arterne. Svampe hypha mister sin integritet i kontakt med væsker og en jævn tørring kan ikke opnås for at genoprette strukturen. På grund af denne effekt, frysetørring er almindeligt anvendt til tørring af bløde væv som svampemycelium. Frysetørring fungerer godt for rene materialer, men tilstedeværelsen af eventuelle salte eller sekretion vil skjule overflade detaljer, der vil blive identificeret kun på SEM visning fase. Vi koblede slide kultur metoden med glutaraldehyd fastgørelse og kritisk punkt tørring for at give strukturelle detaljer af intakt svampe hyfer og sporer. Selv om CPD tørring forårsagede svind i embryoner, det resulterede i velbevarede myceliale strukturer, når kombineret med glutaraldehyd fiksering. Æggeskallen er af største betydning for embryo af ovipar dyr ved ikke kun at fungere som en beskyttende beklædning, men også at give mekanisk stabilitet, permeabilitet til gas og vand, og en calcium reserve til det udviklende embryon. Ferskvands skildpadde æggeskaller klassificeres som “stive” baseret på deres struktur, og på grund af deres tilgængelighed har fået betydelig opmærksomhed fra biologer^{1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38}.

Vi detaljer enkle metoder til nem undersøgelse af æggeskal og Shell membraner af malet skildpadde, der kan anvendes til enhver stiv æggeskal arter. Forberedelses metoderne blev evalueret ud fra den resulterende billedkvalitet og reducerede potentielle artefakter.

Protocol

Bemærk: malet skildpadde (Chrysemys picta) æg, der anvendes i denne undersøgelse blev indsamlet i løbet af nesting sæson af maj til juni 2015-16 fra Rice Creek Field Station, Oswego New York med tilladelse fra New York State Department of Environmental Bevaring (DEC). 1. kemisk tørring metode til at behandle embryoner til SEM Saml skildpadde æg fra marken steder i nesting sæsonen. Forbered inkubations kamrene på forhånd, lavet af plastikkasser med låg (L x b x H) …

Representative Results

Figur 1 Vis scanning elektron mikrografisk analyse af malet skildpadde (Chrysemys picta) embryoner. Malede skildpadde æg indsamlet og inkuberet på en strøelse medium, monteret på aluminium stubbe efter kemisk tørring blev brugt til SEM Imaging (figur 1a-E). En lateral visning af et Stage 12-embryon viser de kraniofaciale strukturer; maxillær fremtrædende rækker ud over mandibulær og begrænser en velafmærket nasal pit medially…

Discussion

I vores undersøgelse, forskellige fikseringsmidler, dehydrering og tørring metoder blev testet til at forberede tre forskellige delikate biologiske prøver til SEM Imaging: embryoner, æggeskaller, og svampekulturer. SEM er almindeligt anvendt til overflade analyse, så fikserings penetration er mindre om, men det skal forstås, at dårligt faste interne strukturer vil forårsage indadgående svind eller/og kollapsede overflade strukturer. Forlænget fikserings tidspunkt bør også overvejes for større vævsprøver, d…

Materials

Agar	Fischer Scientific	S25127A	for slide cultures
Aluminum pin stub	Tedpella	16111	12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotic for media
Coarse Vermiculite	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	bedding medium
Clear 12- well plate	Corning	07-201-589	for fixing embryo
Coverslips	Fischer Scientific	S17525B	for slide culture
Critical Point Dryer	Quorum CPD	EMS850	critical point drying
Culture dishes	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol	Fischer Scientific	A406P 4	dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers	Tedpella	5804	style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde	Fischer Scientific	G151-1	fixative
Gold target for sputter coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	chemical drying agent
Kim wipes	Kimtech	S-8115	cleaning
Microscope slides	Thermo Scientific	67-762-16	for slide culture
Microscopy Scissors	Tedpella	1327	Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors	Tedpella	1346	Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts	Corning	0330B09	15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde	Fischer Scientific	T353 500	fixative
Peat moss	Walmart- Miracle Gro	551705263	bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	thin metal coating
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	electron microscopy