여기에서, 우리는 주사 전자 현미경 검사법 (SEM)를 사용하여 섬세한 조직 견본을 화상 진찰을 위한 상세한 처리 프로토콜을 제시합니다. 세 가지 다른 처리 방법, 즉, hexamethyl disilazana (HMDS) 화학 건조, 간단한 공기 건조 및 임계 점 건조는 각각 경질 계란 껍질, 초기 발달 단계에서 배아 및 곰팡이 배양을 준비하기 위해 설명됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
주사 전자 현미경 검사법 (SEM)은 다양한 생물학적 및 비 생물학적 샘플의 초구조 적 분석에 널리 사용되고 있지만, 다른 생물학적 샘플 처리에 관련된 방법은 독특한 관행을 포함한다. 샘플 처리를 위한 문헌에 설명된 모든 기존 관행은 여전히 유용한 응용 프로그램을 찾을 수 있지만 샘플 준비의 미묘한 변화는 이미지 품질을 변경하고 아티팩트를 도입할 수 있습니다. 따라서, 분석된 조직의 종류에 특이적인 독특한 시료 제제 기술을 사용하여 초구조적 분해능으로 양질의 이미지를 얻을 필요가 있다. 이 연구의 초점은 SEM을 사용하여 화상 진찰 배아, 단단한 계란 껍질 및 곰팡이 문화를 위한 최적 견본 준비 프로토콜을 제공하기 위한 것입니다. 연구된 세 가지 섬세한 생물학적 샘플에 대해 좋은 결과를 얻으려면 다음 최적화가 권장되었습니다. 4% 파라포름알데히드 또는 3% 글루타랄데히드와 같은 더 온화한 고정식을 사용하고 에탄올 시리즈를 사용한 탈수증이 필수적입니다. 슬라이드 배양에 의해 얻어진 한천 블록에 곰팡이 균사체는 한천 플레이트에서 직접 가져온 배양에 비해 더 나은 초구조적 무결성을 산출합니다. HMDS를 사용하여 배아의 화학적 건조는 임계 점 건조에 비해 표면 장력 아티팩트를 도입하지 않고 건조를 제공합니다. HMDS는 시료가 건조 중에 덜 부서지기 때문에 수축으로 인한 균열을 방지합니다. 그러나 곰팡이 배양의 경우, 임계 점 건조는 화학 적 건조에 비해 허용 가능한 이미지 품질을 제공합니다. 달걀 껍질은 장착 전에 철저한 세척 및 공기 건조를 제외하고는 특별한 준비 단계없이 이미지화 할 수 있습니다. 준비 방법론은 각 시험에서 얻은 허용 가능한 이미지 품질에 기초하여 표준화되었다.
서론
주사 전자 현미경 (SEM) 초구조 분석 및 세포 내 이미징 은 원핵 생물, 식물 및 동물의 3 차원 프로파일링을위한 광 현미경 검사법을 보완합니다. SEM의 높은 공간 해상도는 나노미터에서 마이크로미터 척도까지 시편의 미세 구조적 특성을 검사하는 데 사용할 수 있는 가장 다재다능하고 강력한 기술 중 하나입니다. 건조 된 표본은 기능적 관계에 대한 유효한 결론을 개발하기위한 기초를 제공하는 강렬한 세부 사항으로 조성및 지형 구조로 해결1,2,3 , 4개 , 5개 , 6개 , 7명 , 8개 , 9. 생물학적 표본의 SEM 이미지를 해석 할 때, 그것은 네이티브 구조와 처리 중에 생성 된 유물을 구별하는 큰 도전이다. SEM은 일반적으로 샘플
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프로토콜
참고 : 이 연구에 사용되는 페인트 거북이(Chrysemys picta)계란은 뉴욕 주 환경부로부터 얻은 허가를 받아 2015-16 년 5 월부터 6 월까지 뉴욕 주 라이스 크릭 필드 스테이션에서 수집되었습니다. 보존 (12 월).
1. SEM용 배아를 처리하는 화학 건조 방법
- 둥지 시즌 동안 필드 사이트에서 거북이 계란을 수집합니다. 뚜껑 (L x W x H) 6.7 cm x 25.4 cm x 10.2 cm버미와 토탄 모스 (1 :1 비율)의 촉촉한 혼합물로 준비 침구 매체로 채워진 플라스틱 상자로 만든 미리 배양 챔버를 준비합니다. 상자의 측면과 뚜껑을 따라 약 0.25cm의 4-6 구멍을 만들어 폭기를 허용합니다.
- 둥지에서 토양을 부드럽게 제거하여 알을 발견하십시오. 배양 중에 미생물 오염을 제어하기 위해 희석 된 요오드 팅크 (1:25,000)로 거북이 계란의 표면을 닦으십시오. 클러치는 서로 분리놓고, 그려진 거북이의 클러치 크기는 5~9개의 달걀과 상자당 최대 8~9개의 달걀을 놓는다.
참고 : 수집, 닦기, 라벨 링 및 상자 내부에 배치하는 동안 계란을 조심스럽게 처리하십시오. 계란의 위치 및 정렬은 누워 있던 것과 동일해야 하며, 어떤 운동도 배아 발달을 억제합니다.
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결과
도 1은 도장된거북이(Chrysemys picta) 배아의 주사 전자 현미경 분석을 보여준다. 도색된 거북이 알을 침구 배지상에 채취하고 배양하고, 화학건조 후 알루미늄 스텁에 장착하여 SEM 이미징에 사용하였다(도1A-E). 단계 12 배아의 측면보기는 두개안면 구조물을 보여줍니다; 상악 가루는 하악을 넘어 확장하고 잘 표시된 비강 구덩이 내측을 제한; 5개의 인두 아치도 관찰되었다(그림1F). 배아의 후방 꼬리 부위에 새로 형성된 소미트는 분절된 몸소미에 비해 쉽게 계산할 수 있다. 앞다리 싹은 뒷다리 싹에 비해 더 이상 나타나고 통풍구보다 더 많은 포인트. 갑피 능선의 잘 정의된 아웃성장은 단계 15 배아의 전체 사지 측면 영역을 따라 보입니다(도1
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토론
우리의 연구에서, 다른 고정 에이전트, 탈수 및 건조 방법은 SEM 화상 진찰을 위한 3개의 다른 섬세한 생물학 견본을 준비하기 위하여 시험되었습니다: 배아, 계란 껍질 및 곰팡이 배양. SEM은 일반적으로 표면 해석에 사용되므로 고정 관통은 덜 중요하지만 내부 구조가 잘못 고정되면 내부 수축 또는/축소된 표면 구조가 발생할 수 있음을 이해해야 합니다. 연장된 고정 시간은 또한 더 큰 조직 견본을 위해 고려되어야 합니다, 고정 기간에 따라서 고정식 해결책을 몇 번 대체하. 고정식과 조직 사이의 활발한 상호 작용으로 인해 세포의 삼투 특성이 상당히 변할 것입니다. 조직 유체는 고정제를 희석시킬 것이고 따라서 전반적인 삼투에 기여하는 알데히드 효과는 세포 부피에 대한 영향이 우려되는 한 무시될 수 있다. 또한, 포름알데히드는 조직에 더 빨리 침투하고 글루타랄데히드에 비해 크로스 링커로 더 효과적입니다. 완충된 포름알데히드-글루타랄데히드 혼합물은 또한 다양한 조직을 고정하기 위해 보고되었지만, 단층 및 세포 현탁액의 희석 된 용액은<.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다
감사의 글
저자는 다니엘 발다사르 박사에게 감사드리고 싶습니다, SUNY 오스웨고 는 원고에 대한 유용한 토론과 의견에 대한. 이 연구는 라이스 크릭 준회원 보조금에 의해 지원되었다, 오스웨고; 도전 은 PGL과 JG에 SUNY 오스웨고와 국립 과학 재단 (NSF) 작은 보조금을 부여합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agar | Fischer 슬라이드 | 배양을 위한 | S25127A |
| 알루미늄 핀 스텁 | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco 탈수 배양 배지: 감자 포도당 한천 | BD 213400 | DF0013-17-6 | 곰팡이, 효모 및 곰팡이의 분리 및 배양을 위한 배지 |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | 배지용 항생제 |
| 굵은 질석 | 온실 메가 스토어 | SO-VER-12 | 침구 매체 |
| 투명 12 웰 플레이트 | 코닝 | 07-201-589 | 배아 고정 |
| 용 커버 슬립 | 피셔 과학 | 슬라이드 배양 | 용 S17525B |
| 임계 점 건조기 | 정족수 CPD | EMS850 | 임계 점 건조 |
| 배양 접시 | 피셔 사이언티픽 | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| 에탄올 | 피셔 사이언티픽 | A406P 4 | 탈수제 |
| 겸자- 물병자리 핀셋 | Tedpella | 5804 | 스타일 4, 길이 108mm, 너비 x 두께 0.017 x 0.17 mm |
| 글루타르알데히드 | 피셔 사이언티픽 | G151-1 | |
| 스퍼터 코팅기용 고정 골드 타겟 | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | 골드 타겟, 2.375&프라임; D x .002&프라임; |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | 화학 건조제 |
| Kim 닦음 | Kimtech | S-8115 | 청소 |
| 현미경 슬라이드 | Thermo Scientific | 67-762-16 | 슬라이드 배양 |
| 현미경 가위 | Tedpella | 1327 | 더블 포인티드, 스테인리스 스틸, 100mm L (3-5/8"). |
| 마이크로 가위 | Tedpella | 1346 | Vannas 유형, 직선, 80mm L |
| Moria 천공 배아 스푼 | 미세 과학 도구 | 10370-17 | 길이 14.5 cm, 팁 직경 20 mm, 숟가락 깊이 5 mm |
| Netwell 인서트 | Corning | 0330B09 | 15 mm 인서트 74 µ m 메쉬 크기 폴리 에스테르 멤브레인은 다양한 용매로 표본을 처리하는 동안 편리한 캐리어 역할 |
| 파라 포름 알데히드 | Fischer Scientific | T353-500 | 고정 피트 |
| 이끼 | 월마트-미라클 그로 | 551705263 | 침구 매체 |
| PELCO 탭 더블 스틱 탄소 전도성 테이프 | Tedpella | 5000 | 12mm OD |
| 스퍼터 코터 | DENTON VACUUM | DESK V | 얇은 금속 코팅 |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV 주사 전자 범위 | 전자 현미경 |
참고문헌
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M.
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재인쇄 및 허가
