Procesamiento de embriones, cáscara de huevo y cultivo de hongos para escanear microscopía electrónica

Summary

Aquí, presentamos protocolos de procesamiento detallados para la toma de imágenes de muestras de tejido delicadas utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM). Tres métodos de procesamiento diferentes, a saber, el secado químico de hexametil disilazana (HMDS), el secado simple al aire y el secado de puntocrítico se describen para preparar cáscaras de huevo rígidas, embriones en etapas tempranas del desarrollo y cultivos de hongos, respectivamente.

Abstract

Aunque la microscopía electrónica de barrido (SEM) está siendo ampliamente utilizada para el análisis ultraestructural de diversas muestras biológicas y no biológicas, los métodos involucrados en el procesamiento de diferentes muestras biológicas implican prácticas únicas. Todas las prácticas convencionales descritas en la literatura para el procesamiento de muestras todavía encuentran aplicaciones útiles, pero los cambios sutiles en la preparación de la muestra pueden alterar la calidad de la imagen, así como, introducir artefactos. Por lo tanto, se requiere el uso de una técnica única de preparación de muestras específica para el tipo de tejido analizado para obtener una imagen de buena calidad con resolución ultraestructural. El enfoque de este estudio es proporcionar los protocolos óptimos de preparación de muestras para la toma de imágenes embriones, cáscaras de huevo rígidas y cultivos de hongos utilizando SEM. Se recomendaron las siguientes optimizaciones para obtener buenos resultados para las tres muestras biológicas delicadas diferentes estudiadas. El uso de fijadores más suaves como 4% paraformaldehído o 3% glutaraldehído seguido de deshidratación con series de etanol es obligatorio. El micelio fúngico en bloques de agar obtenidos por cultivos de diapositivas produce una mejor integridad ultraestructural en comparación con los cultivos tomados directamente de placas de agar. El secado químico de embriones con HMDS proporciona secado sin introducir artefactos de tensión superficial en comparación con el secado de punto crítico. HMDS previene el agrietamiento causado por la contracción, ya que las muestras son menos frágiles durante el secado. Sin embargo, para el cultivo de hongos, el secado de puntocrítico proporciona una calidad de imagen aceptable en comparación con el secado químico. Las cáscaras de huevo se pueden crear imágenes sin pasos de preparación especiales, excepto para el lavado a fondo y el secado al aire antes del montaje. Las metodologías de preparación se estandarizaron en función de la calidad de imagen aceptable obtenida con cada ensayo.

Introduction

El análisis ultraestructural del microscopio electrónico de barrido (SEM) y la imagen intracelular complementan la microscopía de luz para el perfilado tridimensional de prokaryotes, plantas y animales. La alta resolución espacial de un SEM lo convierte en una de las técnicas más versátiles y potentes disponibles para el examen de las características microestructurales de las muestras a escala de nanómetro a micrómetro. Los especímenes desecados se resuelven en estructuras compositivas y topográficas con detalles intensos, lo que proporciona la base para el desarrollo de conclusiones válidas sobre las relaciones funcionales^{1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. Al interpretar imágenes SEM de especímenes biológicos, es un gran desafío distinguir entre las estructuras nativas y los artefactos que se crean durante el procesamiento. El SEM generalmente se opera a vacíos muy altos para evitar cualquier interferencia de moléculas de gas que afecte a los haces de electrones primarios, secundarios o retrodispersos emitidos por la muestra^10,11. Además, los materiales biológicos son susceptibles a daños por radiación debido a sus propiedades deficientes o no conductoras. Es esencial que los especímenes cargados en el SEM estén completamente secos y libres de contaminantes orgánicos para eliminar cualquier posible desgasificación en un entorno de alto vacío^10,11. Dado que los especímenes biológicos se componen principalmente de agua, se requieren técnicas preparativas adicionales para garantizar que las estructuras nativas se mantengan.

La resolución obtenida se basa en la optimización de métodos de preparación específicos para los tipos de muestras y parámetros instrumentales utilizados. Por lo tanto, es necesario evitar el uso de pasos de procesamiento generalizado para todos los tipos de tejido. Algunos especímenes biológicos requerirán un procesamiento menos estricto para preservar su estructura, mientras que podría ser necesario más tiempo y cuidado para los tipos delicados de muestras para evitar la introducción de artefactos de secado, como la contracción y el colapso. La preparación de muestras es un paso crítico en la toma de imágenes SEM; los resultados de los estudios morfométricos están notablemente influenciados por los procedimientos de preparación de muestras^12,13. Los pasos de preparación comunes para muchas muestras biológicas son la fijación, deshidratación y recubrimiento con un metal como oro, platino o paladio para convertir sus superficies en conductoras para el análisis SEM. La naturaleza y la combinación de pasos utilizados variarán dependiendo del tipo de tejido, y los objetivos específicos del estudio. La acumulación de carga, la sensibilidad al vacío y el daño del haz de electrones plantean problemas al procesar muestras biológicas delicadas y blandas, lo que requiere pasos de procesamiento adicionales para conservar la estructura nativa del objeto. El uso de métodos convencionales como la fijación de tetróxido de osmio, y la deshidratación causan contracción y el colapso de los tejidos delicados^14,15,16,17. El objetivo del estudio es establecer metodologías elegantes derivadas de la combinación de ideas de estudios anteriores con modificaciones para preparar e imaginar tejidos delicados blandos (por ejemplo, embriones de reptiles, cáscara de huevo de tortugas pintadas y cultivos de hongos).

La selección de un método de fijación adecuado es el primer paso más importante para el análisis microscópico de muestras biológicas. La fijación de los tejidos inmediatamente después del aisleo de un organismo es esencial para evitar alteraciones en su morfología debido a la descomposición. Un fijador eficaz debe terminar los procesos celulares permeando las células rápidamente y manteniendo el efecto irreversiblemente para estabilizar la estructura de la muestra para soportar tanto los pasos de procesamiento subsiguientes como el examen bajo el SEM^{17 , 18}. Aunque se conocen varios métodos de fijación química y física, la fijación química se utiliza más comúnmente para especímenes biológicos para evitar cualquier cambio celular debido a la autolisis, putrefacción, y efectos de secado. Hay numerosas formulaciones químicas fijativas discutidas en la literatura^{17,19,20,21,22,23}, fijadores que funcionan por desnaturalización y coagulando macromoléculas biológicas, y las que se fijan mediante macromoléculas reticulantes covalentemente. Los alcoholes se utilizan como fijadores desnaturalizantes que preservan muy mal la ultraestructura y se utilizan principalmente para la microscopía de luz y no se recomiendan para el análisis microscópico electrónico. Los fijativos reticulantes como el formaldehído, el glutaraldehído y el tetróxido de osmio crean reticulación intermolecular e intramolecular entre macromoléculas dentro de los tejidos, proporcionando una excelente preservación de las ultraestructuras^{11 ,24,25,26}. Las muestras biológicas son sensibles a la temperatura. Se recomienda que la temperatura al comienzo de la fijación sea de 4oC para reducir la movilidad lateral de las proteínas de membrana, ralentizar la difusión de moléculas intercelulares y ralentizar la velocidad de fijación¹¹. El tiempo necesario para la fijación de los tejidos depende en gran medida del tamaño de la muestra y de la velocidad a la que el fijador difunde y reacciona con los componentes de la muestra. Una fijación durante la noche en 4% paraformaldehído o 3% de glutaraldehído en PBS a 4oC es el método preferido para el análisis SEM de los especímenes utilizados en este estudio por sus propiedades penetrantes secuenciales, que permiten procesar muestras delicadas más pequeñas^{17 , 18 , 19 , 20 , 27}. Se elimina un paso posterior a la fijación con tetróxido de osmio no sólo debido a su naturaleza tóxica, sino que también se ha encontrado que no implementa ninguna ventaja adicional para mejorar la calidad de imagen de las muestras analizadas en este estudio.

Las muestras biológicas contienen fluidos que interfieren con el funcionamiento de la SEM; por lo tanto, las muestras deben secarse antes de insertarlas en la cámara de muestras SEM. Una vez asegurada la deshidratación, el disolvente debe retirarse del tejido sin crear artefactos en las muestras debido a la tensión/secado superficial. Tres métodos de secado diferentes se utilizaron comúnmente durante el procesamiento de tejidos para imágenes SEM: secado por aire, secado de punto crítico, y muestras de secado por congelación^28,29,30,31. Pocos estudios informan de los tres métodos de secado que producen resultados idénticos con muestras de tejido animal^28,29,30,31. Una práctica general utilizada para especímenes más pequeños es la deshidratación química por una serie de concentración ascendente de alcohol y hexametildisilazane (HMDS), pero los especímenes más grandes se secan utilizando un instrumento de secado de punto crítico (CPD)^32. Durante el proceso de secado, fuerzas considerables formadas en pequeñas cavidades que pasan a través de la muestra por una interfaz líquido/gas; esto puede incluso conducir a un colapso completo de las estructuras huecas³³. Cualquier deformación que se produzca debido al tratamiento podría confundirse como una característica estructural nativa de la muestra. Por lo tanto, se debe eliminar el fenómeno generalizado para el procesamiento y se debe estandarizar un proceso de secado único para cada tipo de tejido, especialmente cuando se analizan muestras de tejido delicadas.

En varios ensayos realizados utilizando varias combinaciones de todos los procesos mencionados, estandarizamos los métodos que se pueden utilizar para el análisis SEM de tres tejidos delicados: embriones de reptiles, cáscaras de huevo de tortugas pintadas y cultivos de hongos. Los biólogos y morfologíadels del desarrollo describen la morfogénesis normal y anormal durante el desarrollo embrionario en animales vertebrados representativos. Las investigaciones sobre las vías de señalización génica dependen de la descripción morfológica de las estructuras novedosas. Para evitar cualquier cambio abrupto en la estructura del embrión vertebrado durante el análisis sem, recomendamos el secado químico después de la deshidratación. El secado químico con HMDS es el método de secado relativamente más reciente y las ventajas incluyenrapidez relativa, facilidad de uso, pérdida de costos y la limitada experiencia y equipo necesarios 9. La CPD es una técnica de secado comúnmente utilizada utilizando CO₂ de paso a través de las muestras a una temperatura y presión específicas. Identificamos que HMDS es adecuado para secar tejidos blandos delicados y permite procesar muestras más grandes en comparación con el secado de puntocrítico, lo que causó una deformación extensa a los tejidos embrionarios. Se han utilizado varios métodos para preparar muestras para imágenes SEM para estudiar las características morfológicas de los hongos^34. Los especímenes fúngicos se fijan comúnmente en tetróxido de osmio seguido de deshidratación de etanol y secado de puntocrítico, lo que puede proporcionar resultados satisfactorios, aunque los efectos tóxicos del tetróxido de osmio^6,7,35 y la pérdida de materiales fúngicos mientras se cambian las soluciones durante el procesamiento son desventajas pronunciadas. La técnica de preparación de muestras utilizando secado al aire sin fijación también se ha practicado^36, pero resulta en estructuras encogidas y colapsadas, y la observación de tales especímenes puede ser fácilmente malinterpretada mientras se caracteriza la especie. La hifa fúngica pierde su integridad en contacto con líquidos y es posible que no se logre un secado uniforme para restaurar la estructura. Debido a este efecto, secar por congelación se utiliza comúnmente para secar tejidos blandos como el micelio fúngico. El secado por congelación funciona bien para materiales limpios, pero la presencia de cualquier sales o secreción oscurecerá los detalles de la superficie que se identificarán solo en la etapa de visualización del SEM. Acoplamos el método de cultivo de diapositivas con la fijación de glutaraldehído y el secado de punto crítico para producir detalles estructurales de hifas y esporas fúngicas intactas. Aunque el secado por CPD causó contracción en embriones, resultó en estructuras miceliales bien conservadas cuando se combina con la fijación de glutaraldehído. La cáscara de huevo es de importancia primordial para el embrión de animales ovíparos, no sólo actuando como una cubierta protectora, sino también proporcionando estabilidad mecánica, permeabilidad al gas y al agua, y una reserva de calcio para el embrión en desarrollo. Las cáscaras de huevo de tortuga de agua dulce se clasifican como “rígidas” en función de su estructura, y debido a su disponibilidad han recibido una atención significativa de los biólogos^{1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38}.

Detallamos métodos simples para un fácil examen de las membranas de cáscara de huevo y concha de tortuga pintada que se pueden aplicar a cualquier especie rígida de cáscara de huevo. Las metodologías de preparación se evaluaron en función de la calidad de imagen resultante y la reducción de los artefactos potenciales.

Protocol

NOTA: Los huevos de tortuga pintada (Chrysemys picta) utilizados en este estudio fueron recogidos durante la temporada de anidación de mayo a junio de 2015-16 de Rice Creek Field Station, Oswego New York con permiso obtenido del Departamento de Medio Ambiente del Estado de Nueva York Conservación (DEC). 1. Método de secado químico para procesar embriones para SEM Recoger huevos de tortuga de sitios de campo durante la temporada de anidación. Preparar las cámaras de inc…

Representative Results

La Figura 1 muestra el análisis micrográfico de electrones de barrido de embriones de tortuga pintada (Chrysemys picta). Se utilizaron huevos de tortuga pintados recogidos e incubados en un medio de cama, montados en talones de aluminio después del secado químico para imágenes SEM (Figura1A-E). Una vista lateral de un embrión en la etapa 12 muestra las estructuras craneofaciales; prominencia maxilar se extiende más allá de la m…

Discussion

En nuestro estudio, se probaron diferentes agentes de fijación, métodos de deshidratación y secado para preparar tres muestras biológicas delicadas diferentes para la toma de imágenes SEM: embriones, cáscaras de huevo y cultivos de hongos. El SEM se utiliza comúnmente para el análisis de superficie, por lo que la penetración fijativa es menos preocupante, pero debe entenderse que las estructuras internas mal fijas causarán una contracción interna o/y estructuras superficiales colapsadas. También se debe consi…

Materials

Agar	Fischer Scientific	S25127A	for slide cultures
Aluminum pin stub	Tedpella	16111	12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotic for media
Coarse Vermiculite	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	bedding medium
Clear 12- well plate	Corning	07-201-589	for fixing embryo
Coverslips	Fischer Scientific	S17525B	for slide culture
Critical Point Dryer	Quorum CPD	EMS850	critical point drying
Culture dishes	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol	Fischer Scientific	A406P 4	dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers	Tedpella	5804	style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde	Fischer Scientific	G151-1	fixative
Gold target for sputter coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	chemical drying agent
Kim wipes	Kimtech	S-8115	cleaning
Microscope slides	Thermo Scientific	67-762-16	for slide culture
Microscopy Scissors	Tedpella	1327	Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors	Tedpella	1346	Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts	Corning	0330B09	15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde	Fischer Scientific	T353 500	fixative
Peat moss	Walmart- Miracle Gro	551705263	bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	thin metal coating
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	electron microscopy