원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑
Summary
우리는 원형 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNA 5′ 폴리포스파타제 처리 및 북부 블롯을 결합하여 원형 RT-PCR 기반 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 불안정한 5′ 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 정규화 단계를 포함하며, 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 차별하고 매핑하는 데 적합하다.
Abstract
식물 미토콘드리아에서, 몇몇 정상 상태 전사체는 전사 개시 (1 차 적인 전사체)에서 파생된 5′ 삼인산염이 있고, 그 외는 5′ 단인산염 생성 후 전사 (처리된 전사)를 포함합니다. 성적 증명서의 두 가지 유형을 구별하기 위해, 몇 가지 전략이 개발되었으며, 그들 대부분은 5 ‘삼인산염의 존재 / 부재에 따라 달라집니다. 그러나, 1 차 5’termini에 있는 삼인산염은 불안정하고, 녹취록의 2개의 모형의 명확한 차별을 방해합니다. 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 차별화하고 매핑하기 위해 cRT-PCR, RNA 5′ 폴리포슈파타제 처리, 정량적 을 결합하여 원형 RT-PCR(cRT-PCR) 기반 전략을 개발했습니다. RT-PCR(RT-qPCR) 및 북부 블롯. 개선으로, 이 전략은 불안정한 5’ 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 RNA 정규화 단계를 포함한다.
이 프로토콜에서 농축 된 미토콘드리아 RNA는 RNA 5 ‘폴리포스파타제에 의해 전처리되어 5’삼중산염을 모노포스페이트로 변환합니다. 순환화 및 역전사 후, 5′ 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA로부터 유래된 2개의 cDNA는 5′ 말단을 처리하고 5’ 폴리포스파타제에 민감하지 않은 옥수수 26S 성숙한 rRNA에 의해 정규화된다. 정규화 후, 1차 및 처리된 전사체는 처리된 RNA로부터 수득된 cRT-PCR 및 RT-qPCR 제품을 비교하여 차별된다. 전사체 테르미니는 cRT-PCR 제품의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 결정된 다음, 북부 블롯에 의해 검증된다.
이 전략을 사용 하 여, 옥수수 미토 콘 드리 온에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서 결정 되었습니다. 일부 미토콘드리아 유전자의 복잡한 전사체 패턴으로 인해, 몇몇 정상 상태 전사체는 북부 얼룩에서 검출되었지만 분화 및/또는 매핑되지 않았습니다. 우리는 이 전략이 다른 식물 미토콘드리아또는 석고에 있는 정상 상태 전사체를 차별하고 지도로 지도하기에 적당한지 확실하지 않습니다.
Introduction
식물 미토콘드리아에서, 많은 성숙및 전구체 RNA는 다중 이소형태로 축적되고, 정상 상태 전사체는 그들의 5′ 끝에있는 차이에 기초하여 2개의 단으로 분할될 수 있습니다 1,2,3, 4. 1 차적인 전사는 전사 개시에서 파생되는 5′ 삼인산염 끝이 있습니다. 대조적으로, 처리된 전사체는 전사 후 처리에 의해 생성된 5′ 단인산염을 갖는다. 2가지 유형의 전사체의 차별 및 매핑은 전사 및 전사 말기 성숙의 근본적인 분자 메커니즘을 해명하는 데 중요하다.
식물 미토콘드리아에서 1 차적인 및 가공된 전사체를 구별하기 위하여는, 4개의 중요한 전략이 개발되었습니다. 첫 번째 전략은 5’삼인산염을 모노포스페이트로 변환하고 RNA 리가제에 의해 원형화될 수 있도록 담배 산 열포스파타제(TAP)로 미토콘드리아 RNA를 미리 치료하는 것입니다. TAP 처리 및 비처리 RNA 샘플의 전사체 풍부는 cDNA 말단(RACE) 또는 원형 RT-PCR(cRT-PCR)의 신속한 증폭에 의해 비교된 후 2,3,4. 두 번째 전략에서, 처리된 전사체는 먼저 터미네이터 5′-인산염 의존성 외핵항 (TEX)을 사용하여 미토콘드리아 RNA로부터 고갈되고, 1차 적인 전사체는 프라이머 확장 분석 5, 6에 의해 매핑됩니다. . 세 번째 전략은 guanylyl 트랜스퍼라제를 사용하여 1차 전사체를 미리 캡을 씌우고, 트리포스피테5’의 위치는 리보누클레아제 또는 S1 뉴클레아제 보호 분석과 함께 프라이머 확장에 의해 결정되는7,8 ,9. 5′ 삼인산염의 존재/부재에 따라 다른, 네 번째 전략은 시험관 내 전사, 사이트 지시 돌연변이 발생 및 프라이머 확장 분석을 결합하여 가양성 프로모터를 특성화하고 전사를 결정합니다. 개시 사이트8,10,11. 이러한 전략을 사용 하 여, 많은 기본 및 처리 된 전사체 식물 미토 콘 드리 아에서 결정 되었습니다.
그러나, 몇몇 연구 결과는 1 차적인 전사체의 5′ 삼인산염이 불안정했다는 것을 보고하고, 그(것)들은 알 수 없는 이유 2, 4,12,13를위해 monophosphate로 쉽게 변환되었다. 이 문제는 5’triphosphate의 존재/부재에 따라 기술을 사용하여 두 가지 유형의 성적 증명서의 명확한 차별을 방해하고, 공장에서 기본 및 처리 된 성적 증명서 를 체계적으로 구별하기위한 이전의 노력 미토콘드리아실패 2,12.
본 프로토콜에서, 우리는 옥수수에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 구별하기 위해 cRT-PCR, RNA 5′ 폴리포스파타제처리, RT-qPCR 및 노던 블롯을 결합한다(그림 1). cRT-PCR은 RNA 분자의 5′ 및 3’사지의 동시 매핑을 허용하며, 일반적으로 식물 2,12,14,15에서전사체 termini를 매핑하도록 조정된다. RNA 5′ 폴리포스파타제는 트리포스피페테5′ 테르미니에서 2개의 인산염을 제거할 수 있으며, 이는 RNA 리가제에 의한 자가 결찰을 위해 1차 전사체를 사용할 수 있게 한다. 이전 연구는 옥수수에서 성숙한 26S rRNA가 5’종기를 처리했다는 것을 보여주었고, RNA 5’polyphosphatase1,16에민감하지 않았습니다. 1차 5’termini에서 불안정한 삼인산염의 영향을 최소화하기 위해, 5′ 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA는 성숙한 26S rRNA에 의해 정규화되고, 1차 및 처리된 전사체는 다음을 비교하여 분화됩니다. 2개의 RNA 샘플로부터 수득된 cRT-PCR 제품. cRT-PCR 매핑 및 판별 결과는 각각 노던 블롯과 RT-qPCR에 의해 검증됩니다. 마지막으로, 대체 프라이머는 cRT-PCR에 의해서가 아니라 북부 블롯에서 검출된 전사체를 증폭시키는 데 사용된다. 이 cRT-PCR 기반 전략을 사용하여, 옥수수 미토콘드리아에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서는 차별화되고 매핑된1.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전 연구에서, 애기장대의 세포 현탁물 배양으로부터의 총 및 미토콘드리아 RNA는 cRT-PCR에 의해 미토콘드리아 전사체 종기를 매핑하는데 사용되었고, 유사한 결과를12로얻었다. 그러나, 농축된 미토콘드리아 RNA만이 많은 다른 연구에서 미토콘드리아 전사체 termini를 맵메이상으로 사용하였으며 1, 2,3,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (교부금 번호 31600250, Y.Z.), 광저우 시의 과학 기술 프로젝트 (보조금 번호 201804020015, H.N.), 중국 농업 연구 시스템 (보조금 없음)에 의해 지원되었다. CARS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5′ end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5′ and 3′ end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5′ ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5′-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).
