Aislamiento rápido de macrófagos de ganando de raíz dorsal
Summary
Aquí presentamos un protocolo de disociación mecánica para aislar rápidamente los macrófagos del ganglio de la raíz dorsal para el fenotipado y el análisis funcional.
Abstract
Hay intereses crecientes para estudiar las interacciones moleculares y celulares entre las células inmunitarias y las neuronas sensoriales en los ganglios de la raíz dorsal después de la lesión del nervio periférico. Se sabe que las células monocíticas periféricas, incluidos los macrófagos, responden a una lesión tisular a través de la fagocitosis, la presentación de antígenos y la liberación de citoquinas. La evidencia emergente ha implicado la contribución de los macrófagos de los ganglios de raíz dorsal al desarrollo del dolor neuropático y la reparación axonal en el contexto de la lesión nerviosa. Se desea fenoticante rápidamente (o “aislamiento rápido de”) la respuesta de los macrófagos de ganglios de raíz dorsal en el contexto de una lesión nerviosa para identificar los factores neuroinmunes desconocidos. Aquí demostramos cómo nuestro laboratorio aísla rápida y eficazmente los macrófagos de los ganglios de la raíz dorsal utilizando un protocolo de disociación mecánica libre de enzimas. Las muestras se mantienen en hielo para limitar el estrés celular. Este protocolo consume mucho menos tiempo en comparación con el protocolo enzimático estándar y se ha utilizado rutinariamente para nuestro análisis de clasificación de células activado por fluorescencia.
Introduction
Ahora hay evidencia considerable de que las células inmunitarias contribuyen al dolor neuropático después de la lesión del nervio periférico1,2. Se sabe que las células monocíticas periféricas, incluidos los macrófagos maduros, responden a lesiones tisulares e infecciones sistémicas a través de la fagocitosis, la presentación de antígenos y la liberación de citoquinas. Paralelamente a la activación de microglia inducida por una lesión nerviosa en el cuerno dorsal espinal, los macrófagos en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) también se expanden significativamente después de la lesión nerviosa3,4. En particular, hay intereses crecientes para determinar si los macrófagos contribuyen al desarrollo del dolor neuropático después de la lesión del nervio periférico interactuando con las neuronas sensoriales en el DRG5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Además, estudios recientes también implican la contribución de los macrófagos DRG en la reparación axonal después de una lesión nerviosa12,13. Otro estudio sugiere además que las subpoblaciones de macrófagos (es decir, CD11b+Ly6Chi y CD11b+Ly6Ccélulas bajas/-) pueden desempeñar un papel diferente en la hipersensibilidad mecánica14. Por lo tanto, el fenotipado rápidamente de la respuesta de los macrófagos DRG en el contexto de una lesión nerviosa puede ayudarnos a identificar factores neuroinmunes que contribuyen al dolor neuropático.
Convencionalmente, el protocolo para aislar los macrófagos en el DRG implica múltiples pasos incluyendo la digestión enzimática15,16. La técnica a menudo consume mucho tiempo y puede ser costosa para experimentos a gran escala. Aunque se recomendópreviamentela digestión leve con colagenasa tipo II (4 mg/ml) y dispasa tipo II (4,7 mg/ml) durante 20 min, es concebible que las células después de la exposición a esta enzima sean propensas a daños celulares o a la muerte celular, lo que puede conducir a un bajo Rendimiento. Además, la diferencia en la calidad de las enzimas de lote a lote puede afectar aún más la eficiencia de este proceso. Lo que es más importante, los macrófagos expuestos a la digestión enzimática pueden estimularse indeseablemente y, por lo tanto, pueden ser muy diferentes del estado in vivo. Los cambios pueden complicar potencialmente el resultado del estudio funcional.
Aquí describimos un protocolo libre de enzimas para aislar rápidamente los macrófagos DRG a 4 oC utilizando la disociación mecánica. Las muestras se mantienen en hielo para limitar el estrés celular. Como resultado, nuestro enfoque proporciona una ventaja para mantener la consistencia del aislamiento, y las células aisladas son presumiblemente más saludables y menos estimuladas. Además, presentamos la evidencia para validar la calidad de las células aisladas con análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí introducimos un nuevo método para enriquecer eficazmente los macrófagos aislados del DRG de ratón. El enfoque convencional para aislar las células inmunitarias DRG requiere digestión enzimática15,18, que ahora se sustituye por la homogeneización mecánica en nuestro protocolo para limitar el daño celular no deseado y aumentar el rendimiento. Por lo tanto, el nuevo protocolo consume mucho menos tiempo. Más importante aún, la digestión enzimática …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por: Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); el Departamento de Anestesia y Cuidado Perioperatorio (XY) de la UCSF; y 1R01NS100801-01(GZ). Este estudio fue apoyado en parte por HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility a través de una subvención del NIH (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
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