Summary

Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon

Published: September 07, 2019
doi:

Summary

Burada, fenotitipleme ve fonksiyonel analiz için dorsal kök ganglion’undaki makrofajları hızla izole etmek için mekanik bir ayrışma protokolü salıyoruz.

Abstract

Periferik sinir hasarı sonrası dorsal kök gangliyonunda bağışıklık hücreleri ve duyusal nöronlar arasındaki moleküler ve hücresel etkileşimleri incelemek için artan ilgi alanları vardır. Makrofajlar da dahil olmak üzere periferik monositik hücrelerin fagositoz, antijen sunumu ve sitokin salınımı yoluyla doku hasarına yanıt verebildiği bilinmektedir. Ortaya çıkan kanıtlar sinir hasarı bağlamında nöropatik ağrı gelişimi ve aksonal onarım dorsal kök gangliyon makrofajlar katkısı ima etmiştir. Hızla fenotipleme (veya “hızlı izolasyon”) sinir yaralanması bağlamında dorsal kök ganglia makrofajlarının yanıtı bilinmeyen nöroimmün faktörleri belirlemek için istenir. Burada laboratuvarımızın enzimsiz mekanik ayrışma protokolü kullanarak dorsal kök ganglinden makrofajları nasıl hızlı ve etkili bir şekilde izole ettiğimizi gösteriyoruz. Örnekler hücresel stresi sınırlamak için boyunca buz üzerinde tutulur. Bu protokol standart enzimatik protokole göre çok daha az zaman alır ve floresan tarafından aktive edilen Hücre Sıralama analizlerimiz için rutin olarak kullanılmaktadır.

Introduction

Bağışıklık hücrelerinin periferik sinir hasarı sonrası nöropatik ağrıkatkıda önemli kanıtlar var1,2. Olgun makrofajlar da dahil olmak üzere periferik monositik hücrelerin fagositoz, antijen sunumu ve sitokin salınımı yoluyla doku hasarına ve sistemik enfeksiyona yanıt verebildiği bilinmektedir. Spinal dorsal boynuz sinir yaralanması kaynaklı mikroglia aktivasyonu paralel, dorsal kök gangliyonu makrofajlar (DRG) ayrıca sinir yaralanması sonra önemli ölçüde genişletmek3,4. Özellikle, makrofajlar DRG duyusal nöronlar ile etkileşime girerek periferik sinir yaralanması sonrası nöropatik ağrı gelişimine katkıda olup olmadığını belirlemek için büyüyen ilgi vardır5,6,7, 8.000 , 9.000 , 10.000 , 11. Ayrıca, son çalışmalar da sinir yaralanması12sonra aksonal onarım DRG makrofajların katkısı ima12 ,13. Başka bir çalışmada ayrıca makrofaj alt popülasyonlarının (cd11b+Ly6Chi ve CD11b+Ly6Cdüşük/- hücreler) mekanik aşırı duyarlılıkta farklı bir rol oynayabileceğini öne sürer14. Bu nedenle, sinir hasarı bağlamında DRG makrofajların yanıtını hızla fenotipleme bize nöropatik ağrıya katkıda nöroimmün faktörleri belirlemenize yardımcı olabilir.

Geleneksel olarak, DRG makrofajlar izole etmek için protokol enzimatik sindirim 15 ,16dahil olmak üzere birden fazla adım içerir. Teknik genellikle zaman alıcıdır ve büyük ölçekli deneyler için maliyetli olabilir. Kollajenaz tip II (4 mg/mL) ve dispase tip II (4.7 mg/mL) ile hafif sindirim daha önce tavsiye edilse de15dakika , bu enzime maruz kaldıktan sonra hücrelerin hücre hasarına veya hücre ölümüne yatkın olması akla yatkındır, bu da düşük hücre hasarına veya hücre ölümüne yol açabilir Verim. Buna ek olarak, seriden toplu ait enzimlerin kalitesindeki fark bu sürecin verimliliğini daha da etkileyebilir. Daha da önemlisi, enzim sindirimine maruz kalan makrofajlar istenmeyen bir şekilde uyarılabilir ve böylece in-vivo durumundan çok farklı olabilir. Değişiklikler, fonksiyonel çalışmanın sonucunu karmaşık hale getirebilir.

Burada 4 °C’de DRG makrofajlarını mekanik ayrışma kullanarak hızla izole etmek için enzimsiz bir protokol uyguluyoruz. Örnekler hücresel stresi sınırlamak için buzüzerinde tutulur. Sonuç olarak, bizim yaklaşım izolasyon tutarlılığını korumak için bir avantaj sağlar, ve izole hücreler muhtemelen sağlıklı ve daha az uyarılmış. Ayrıca Floresan aktive Hücre Sıralama (FACS) analizi ile izole hücrelerin kalitesini doğrulamak için kanıt salıyoruz.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri California San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi’ne uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Deneysel farelerden lomber DRG toplamak Deneye başlamadan önce, 9 ciltlik ortayı 1 birim Ca++ /Mg++-free 10x HBSS ile karıştırarak yoğunluk gradyan ortamının (örneğin, Percoll) çalışma çözümünün hazırlanın. Buz…

Representative Results

İzole hücreleri doğrulamak için, ilk Macrofaj Fas kaynaklı Apoptosis seçti (MAFIA) transgenik fareler17. Bu çizgi, özellikle makrofajlar ve mikroglia ile ifade edilen BOS1 reseptörünün (BOS1R) promotörü kontrolü altında ilaç lainebilir fk506 bağlayıcı protein (FKBP)-Fas intihar füzyon geni ve yeşil floresan proteini (eGFP) ifade eder. FK bağlayıcı protein dimerizer sistemik enjeksiyon, AP20187 (AP), transgeni ifade eden hücrelerin apoptosis indükler. EGFP ifadesi de bize …

Discussion

Burada etkili fare DRG izole makrofajlar zenginleştirmek için yeni bir yöntem tanıtmak. DRG bağışıklık hücrelerini izole etmek için geleneksel yaklaşım enzimatik sindirim gerektirir15,18, şimdi istenmeyen hücre hasarı sınırlamak ve verimi artırmak için protokolümüzde mekanik homojenizasyon ile değiştirilir. Bu nedenle, yeni protokol çok daha az zaman alıcıdır. Daha da önemlisi, enzim sindirim makrofajlar uyarabilir ve moleküler imzay…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışma şu şekilde desteklenmiştir: Anestezi Eğitim ve Araştırma Vakfı (XY); UCSF Anestezi ve Perioperatif Bakım Bölümü (XY); ve 1R01NS100801-01(GZ). Bu çalışma kısmen HDFCCC Laboratuvar Hücre Analizi Paylaşılan Kaynaklar Tesisi tarafından NIH (P30CA082103) hibe si ile desteklenmiştir.

Materials

AP20187 Clontech 635058
a-mouse CX3CR1-APC antibody Biolegend 149007
Avertin Sigma T48402
Cell strainer (70 mm nylon) Falcon 352350
Centrifuge Eppendorf 5810R
Dounce tissue homogenizer Wheaton 357538 (1ml)
FACS tubes (5ml) Falcon 352052
Friedman-Pearson Rongeur FST 16121-14
HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) Gibco 14185-052
Noyes Spring Scissor FST 15012-12
Percoll Sigma P4937-500ml
Propidium iodide Sigma P4864-10ml

References

  1. Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
  2. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
  3. Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
  4. Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
  5. Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
  6. Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
  7. Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
  8. Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
  9. Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
  10. Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
  11. Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
  12. Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
  13. Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
  14. Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
  15. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
  16. Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
  17. Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
  18. Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
  19. Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  20. Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).

Play Video

Cite This Article
Yu, X., Leff, J., Guan, Z. Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages. J. Vis. Exp. (151), e60023, doi:10.3791/60023 (2019).

View Video