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유전학

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

Published: August 23, 2019
doi:
10.3791/60039
,
1Howard Hughes Medical Institute,New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

Summary

이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.

Abstract

염색질 도메인의 조직 과 구조는 개별 세포 계에 고유합니다. 그들의 잘못된 조절은 세포 정체성 및 / 또는 질병에 있는 손실로 이끌어 낼 수 있습니다. 엄청난 노력에도 불구하고 염색질 도메인의 형성과 전파에 대한 우리의 이해는 여전히 제한적입니다. 크로마틴 도메인은 안정된 상태 조건 하에서 연구되어 왔으며, 이는 설립 기간 동안 초기 사건을 따르는 데 도움이되지 않습니다. 여기에서는 염색질 도메인을 유도적으로 재구성하고 시간의 함수로 재형성을 따르는 방법을 제시합니다. 비록, 먼저 PRC2 매개 억압 크로마틴 도메인 형성의 경우에 적용, 그것은 쉽게 다른 염색질 도메인에 적응 될 수 있었다. 유전체학 및 이미징 기술과 이 방법의 수정 및/또는 조합은 크로마틴 도메인의 설립을 매우 자세하게 연구하는 귀중한 도구를 제공할 것입니다. 우리는 이 방법이 염색질 도메인이 어떻게 형성되고 상호 작용하는지에 대한 우리의 이해에 혁명을 일으킬 것이라고 믿습니다.

Introduction

진핵 게놈은 고도로 조직되고 염색질 접근성에 있는 변경은유전자 전사 1을 직접 통제합니다. 게놈은 전사 활동 및 복제 타이밍2,3와상관 관계가 있는 염색질 도메인의 명백한 모형을 포함합니다. 이러한 염색질 도메인은 몇 킬로베이스(kb)에서 100kb 이상까지 의 크기 범위이며 뚜렷한 히스톤변형 4의 농축을 특징으로 한다. 핵심 질문은 이러한 도메인이 어떻게 형성되고 어떻게 전파되는가하는 것입니다.

가장 잘 특징지어진 염색질 도메인 중 하나는 폴리콤 억압 복합체 2(PRC2)의 활성을 통해 육성된다. PRC2는단백질5,6의폴리콤 그룹(PcG)의 서브세트로 구성된 다중 소단위 복합체로, 히스톤 H3(H3K27me1/me2/me3)의 리신 27의 모노, 디-및트리메틸화를 촉매한다. 9,10. H3K27me2/me3는 억압적인 염색질 상태와 관련이 있지만 H3K27me1의 기능은불분명합니다 6,11. 중화민의 핵심 구성 요소 중 하나인 배아 외배엽 발달(EED)은, 그 방향족 케이지를 통해 PRC2 촉매, H3K27me3의 최종 생성물인 PrC212,13의알로스테릭 자극을 초래한다. PRC2 효소 활동은 특정 혈통에 대한 금기 특정 발달 유전자의 부적절한 발현으로 개발 중 세포 정체성을 보존하는데 매우 중요하며, 5, 6에 해가 될 것입니다. . 따라서, PRC2가 포유류에서 억압적인 염색질 도메인의 형성을 촉진하는 메커니즘을 해명하는 것은 세포 정체성을 이해하는 데 근본적으로 중요합니다.

PRC2 매개 염색질 도메인을 포함하여 염색질 도메인 형성을 조사하기 위해 고안된 모든 과거 실험 시스템은 염색질 도메인 형성의 전개 이벤트를 추적할 수 없는 정상 상태 조건하에서 수행되었습니다. 셀. 여기에서는 염색질 도메인의 초기 모집 및 전파를 모니터링하는 유도성 셀룰러 시스템을 생성하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 특히, 우리는 H3K27me2/3를 구성하는 PRC2 매개 억압성 염색질 도메인의 형성을 추적하는 데 중점을 둡니다. 염색질 도메인 형성의 기계적 세부 사항을 캡처할 수 있는 이 시스템은 H2AK119ub 또는 H3K9me을 포함하는 널리 연구된 도메인과 같은 다른 염색질 도메인을 통합하도록 적응될 수 있습니다. 유전체학 및 이미징 기술과 결합하여, 이 접근법은 염색질 생물학에 있는 각종, 중요한 질문을 성공적으로 해결하는 잠재력을 가지고 있습니다.

Protocol

유도성 EED 구조 MES 생성 1. 세포 배양 피더 프리 C57BL/6 마우스 배아 줄기 세포(mESCs)를 사용하여 안정적으로 통합된 CreERT2 이식유전자를 보유하며, 이는 4-하이드록시타목시펜(4-OHT)의 투여 시 핵으로 전이할 수 있다 13. 기존의 ESC 배지14,15에서mESCs를 성장시키고, 1000 U/mL LIF, 1 μM ERK 억제제 P…

Representative Results

조건부 구조 시스템의 일반적인 계획도 1은 내인성 EED 궤적으로부터 발현되는 WT 또는 케이지 돌연변이체(Y365A) EED를 사용하여 EED KO 세포를 조건부로 구출하는 표적화 방식을 나타낸다. 안정성과 효소 활성에 필수적인 PRC2의 핵심 하위 단위인 EED를 노크한 후, EED의 엑손 9에 이어인트론 내의 카세트가 도입된다(그림 1). 카세트는 내인성 ?…

Discussion

주어진 염색질 도메인의 형성 도중 기계론적인 세부사항을 이해하는 쪽으로 강력한 접근은, 먼저 도메인을 중단하고 세포 내의 진행 중인 그것의 재건을 추적하는 것입니다. 이 프로세스는 재구성 중에 언제든지 일시 중지되어 진행 중인 이벤트를 자세히 분석할 수 있습니다. 염색질 도메인에 대한 이전 연구는 정상 상태 조건(예: 야생형 및 유전자 녹아웃 비교)에서 수행되었기 때문에 이러한 이…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

엘 발레스 박사, 디 오자타 박사, 에이치 무 박사님에게 원고 개정에 감사드립니다. D.R. 연구소는 하워드 휴즈 의학 연구소와 국립 보건원 (R01CA199652 및 R01NS100897)에 의해 지원됩니다.

Materials

(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) Sigma H7904-5MG For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) Electron Microscopy Sciences 15710 For immunofluorescence
2-mercaptoethanol LifeTechnologies 21985-023 For mESCs culture
2% Gelatin Solution Sigma G1393-100ml For mESCs culture
Accutase 500 ML Innovative Cell Tech/FISHER AT 104-500 For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresaerch 711-585-152 For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium FISHER/VWR 41799-008 For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK Fisher Sci 177445PK For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg Life Tech D1306 For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901 Stemgent 04-0006 For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Millipore/Fisher ESG1107 For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified Atlanta S10250 For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021 Stemgent 04-0004 For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB Cell Signaling 9728S Antibody for ChIP-seq
H3K27me3 Cell Signaling 9733S Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb) Active motif 39715 Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM Invitrogen 10829-018 For mESCs culture
L-glutamine Sigma G7513 For mESCs culture
Lipofectamine 2000 LifeTech 11668019 For transfection
MangoTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21079 For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin Sigma/Roche P0781 For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T For Genotyping PCR
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit Thermo Fisher K270020 For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1 Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2 Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1 Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1 Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1 Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1 Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2 Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2 Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
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References

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Keywords: Chromatin DomainsPRC2CRISPREEDMouse Embryonic Stem CellsGenotypingDonor Template DNA
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Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains. J. Vis. Exp. (150), e60039, doi:10.3791/60039 (2019).
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