طريقة لدراسة تشكيل دي نوفو من مجالات الكروماتين
Summary
تم تصميم هذه الطريقة لمتابعة تشكيل مجالات الكروماتين بوساطة PRC2 في خطوط الخلايا، ويمكن تكييف الطريقة مع العديد من الأنظمة الأخرى.
Abstract
تنظيم وهيكل مجالات الكروماتين فريدة من نوعها لسلالات الخلايا الفردية. وقد يؤدي سوء تنظيمها إلى فقدان الهوية الخلوية و/أو المرض. على الرغم من الجهود الهائلة، فإن فهمنا لتكوين وانتشار مجالات الكروماتين لا يزال محدوداً. وقد درست مجالات الكروماتين في ظل ظروف الحالة الثابتة، والتي لا تؤدي إلى متابعة الأحداث الأولية أثناء إنشائها. هنا، نقدم طريقة لإعادة بناء مجالات الكروماتين بشكل غير صحيح واتباع إعادة تشكيلها كدالة للوقت. على الرغم من أنه، تطبيق لأول مرة على حالة تكوين المجال الكروماتين القمعية بوساطة PRC2، فإنه يمكن تكييفها بسهولة مع مجالات الكروماتين الأخرى. وسيؤدي تعديل و/أو الجمع بين هذه الطريقة وتكنولوجيات علم الجينوم والتصوير إلى توفير أدوات لا تقدر بثمن لدراسة إنشاء مجالات الكروماتين بقدر كبير من التفصيل. ونحن نعتقد أن هذه الطريقة سوف تحدث ثورة في فهمنا لكيفية تشكيل مجالات الكروماتين والتفاعل مع بعضها البعض.
Introduction
الجينوم Eukaryotic هي منظمة للغاية والتغيرات في إمكانية الوصول الكروماتين يتحكم مباشرة في نسخ الجينات1. يحتوي الجينوم على أنواع متميزة من مجالات الكروماتين، والتيترتبط بنشاط النسخ ووقت النسخ المتماثل 2،3. تتراوح هذه المجالات الكروماتين في الحجم من عدد قليل من كيلوباسي (كيلو بايت) إلى أكثر من 100 كيلو بايت وتتميز بإثراء في تعديلات الهيستون متميزة4. والأسئلة الرئيسية هي: كيف تتشكل هذه المجالات وكيف يتم نشرها؟
يتم تعزيز واحدة من مجالات الكروماتين الأكثر تميزا من خلال نشاط مجمع بوليكومب القمعية 2 (PRC2). PRC2 هو مجمع متعدد الوحدات الفرعية يتكون من مجموعة فرعية منمجموعة بوليكومب (PcG) من البروتينات 5،6،ويحفز أحادية، دي، وثلاثي ة من يسين 27 من الهيستون H3 (H3K27me1/me2/me3)7،8، 9،10. ويرتبط H3K27me2/me3 مع حالة الكروماتين القمعية، ولكن وظيفة H3K27me1 غير واضح6،11. واحدة من المكونات الأساسية لPRC2، تطوير ectoderm الجنينية (EED)، يربط إلى المنتج النهائي من الحفز PRC2، H3K27me3، من خلال قفصه العطرية وهذه الميزة النتائج في تحفيز allosteric من PRC212،13. نشاط PRC2 الأنزيمي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الهوية الخلوية أثناء التنمية كما التعبير غير المناسب لبعض الجينات التنموية التي يتم بطلان لسلالة معينة، سيكون ضارا5،6 . وبالتالي، فإن تفكيك الآليات التي تعزز بها PRC2 تشكيل مجالات الكروماتين القمعية في الثدييات له أهمية أساسية لفهم الهوية الخلوية.
تم تنفيذ جميع الأنظمة التجريبية السابقة المصممة للتحقيق في تكوين نطاق الكروماتين بما في ذلك مجالات الكروماتين بوساطة PRC2، في ظل ظروف ثابتة الحالة، والتي هي غير قادرة على تتبع الأحداث التي تتكشف من تكوين المجال الكروماتين في الخلايا. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لتوليد نظام خلوي غير قابل للتشغيل الذي يراقب التوظيف الأولي ونشر مجالات الكروماتين. وعلى وجه التحديد، نركز على تتبع تشكيل نطاقات الكروماتين القمعية التي تتوسط فيها PRC2 التي تضم H3K27me2/3. هذا النظام الذي يمكن التقاط التفاصيل الميكانيكية لتكوين المجال الكروماتين، يمكن تكييفها لتشمل مجالات الكروماتين الأخرى، مثل المجالات التي درست على نطاق واسع التي تتألف إما H2AK119ub أو H3K9me. وإلى جانب علم الجينوم وتقنيات التصوير، ينطوي هذا النهج على إمكانية معالجة مختلف المسائل الرئيسية في بيولوجيا الكروماتين بنجاح.
Protocol
Representative Results
Discussion
نهج قوي نحو فهم التفاصيل الميكانيكية أثناء تشكيل مجال كروماتين معين، هو أولا تعطيل المجال ومن ثم تتبع إعادة بنائه في التقدم داخل الخلايا. يمكن إيقاف العملية مؤقتاً في أي وقت أثناء إعادة الإعمار لتحليل الأحداث الجارية بالتفصيل. ولم تتمكن الدراسات السابقة المتعلقة بمجالات الكروماتين من حل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورس ل. فالى، د. أوزاتا وه. مو على مراجعة المخطوطة. ويدعم مختبر D.R. من قبل معهد هوارد هيوز الطبي والمعاهد الوطنية للصحة (R01CA199652 و R01NS100897).
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
- Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
- Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
- Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
- Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
- Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
- Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
- Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
- Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
- Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
- Benchling for Academics. Benchling Available from: https://benchling.com (2018)
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
- Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- . UCSC Genome Browser Home Available from: https://genome.ucsc.edu (2019)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
- Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).
