Een methode om de Novo vorming van Chromatin domeinen te bestuderen
Summary
Deze methode is ontworpen om de vorming van PRC2-gemedieerde chromatine-domeinen in cellijnen te volgen, en de methode kan worden aangepast aan vele andere systemen.
Abstract
De organisatie en structuur van chromatine domeinen zijn uniek voor individuele celkilometer standen. Hun misregulering zou kunnen leiden tot een verlies van cellulaire identiteit en/of ziekte. Ondanks enorme inspanningen is ons begrip van de vorming en voortplanting van chromatine domeinen nog steeds beperkt. Chromatin domeinen zijn bestudeerd onder steady-state omstandigheden, die niet bevorderlijk zijn voor het volgen van de eerste gebeurtenissen tijdens hun oprichting. Hier presenteren we een methode om chromatine-domeinen te reconstrueren en hun re-formatie als functie van de tijd te volgen. Hoewel, eerst toegepast op het geval van PRC2-gemedieerde repressief chromatine domein vorming, het kan gemakkelijk worden aangepast aan andere chromatine domeinen. De wijziging van en/of de combinatie van deze methode met Genomics en beeldvormings technologieën zal waardevolle hulpmiddelen bieden om de oprichting van chromatine domeinen in detail te bestuderen. Wij geloven dat deze methode zal een revolutie in ons begrip van hoe chromatine domeinen vormen en interactie met elkaar.
Introduction
Eukaryotische genomen zijn sterk georganiseerd en veranderingen in de chromatine toegankelijkheid regelt direct Gene transcriptie1. Het genoom bevat verschillende soorten chromatine domeinen, die correleren met transcriptionele activiteit en replicatie timing2,3. Deze chromatine domeinen variëren in grootte van een paar kilo bases (KB) tot meer dan 100 kB en worden gekenmerkt door een verrijking in verschillende Histon-modificaties4. De centrale vragen zijn: hoe worden deze domeinen gevormd en hoe worden ze gepropageerd?
Een van de meest goed gekenmerkte chromatine domeinen wordt bevorderd door de activiteit van de Polycomb repressieve complex 2 (PRC2). PRC2 is een multi-subunit complex bestaande uit een subset van de Polycomb groep (PCG) van eiwitten5,6, en katalyseert de mono-, di-en trimethylation van lysine 27 van Histon H3 (H3K27me1/ME2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 worden geassocieerd met een repressief chromatine staat, maar de functie van H3K27me1 is onduidelijk6,11. Een van de kerncomponenten van PRC2, embryonale Ectoderm ontwikkeling (eed), bindt zich aan het eindproduct van PRC2 katalyse, H3K27me3, door zijn aromatische kooi en deze functie resulteert in de allosterische stimulatie van PRC212,13. De PRC2 enzymatische activiteit is cruciaal voor het behoud van de cellulaire identiteit tijdens de ontwikkeling, omdat de ongepaste expressie van bepaalde ontwikkelings genen die gecontra-indiceerd zijn voor een specifieke afstamming, schadelijk zou zijn op6,5 . Daarom is het ontraveling van de mechanismen waarmee PRC2 de vorming van repressieve chromatine-domeinen in zoogdieren bevordert, van fundamenteel belang om de cellulaire identiteit te begrijpen.
Alle uit het verleden experimentele systemen die zijn ontworpen om de chromatine-domein vorming te onderzoeken, waaronder PRC2-gemedieerde chromatine-domeinen, werden uitgevoerd onder steady-state omstandigheden, die niet in staat zijn om de ontvouwende gebeurtenissen van chromatine-domein vorming bij te houden in Cellen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om een induceerbaar cellulair systeem te genereren dat de initiële werving en verspreiding van chromatine-domeinen bewaakt. Concreet richten we ons op het volgen van de vorming van PRC2 gemedieerde repressief chromatine domeinen die H3K27me2/3 vormen. Dit systeem dat de mechanistische Details van chromatine domein vorming kan vastleggen, kan worden aangepast om andere chromatine domeinen op te nemen, zoals de breed bestudeerde domeinen bestaande uit H2AK119ub of H3K9me. In combinatie met Genomics-en beeldvormings technologieën heeft deze aanpak het potentieel om diverse, belangrijke vragen in de chromatide biologie succesvol aan te pakken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een krachtige benadering van het begrijpen van de mechanistische details tijdens de vorming van een gegeven chromatine domein, is om eerst het domein te verstoren en vervolgens de wederopbouw in de vooruitgang in cellen volgen. Het proces kan op elk gewenst moment tijdens de reconstructie worden onderbroken om de gebeurtenissen in uitvoering gedetailleerd te analyseren. Eerdere studies over chromatine domeinen waren niet in staat om dergelijke gebeurtenissen op te lossen zoals ze werden uitgevoerd onder steady-state omst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken drs. L. Vales, D. Ozata en H. MOU voor de revisie van het manuscript. Het D.R. lab wordt ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute en de National Institutes of Health (R01CA199652 en R01NS100897).
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
- Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
- Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
- Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
- Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
- Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
- Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
- Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
- Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
- Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
- Benchling for Academics. Benchling Available from: https://benchling.com (2018)
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
- Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- . UCSC Genome Browser Home Available from: https://genome.ucsc.edu (2019)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
- Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).
