이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.
염색질 도메인의 조직 과 구조는 개별 세포 계에 고유합니다. 그들의 잘못된 조절은 세포 정체성 및 / 또는 질병에 있는 손실로 이끌어 낼 수 있습니다. 엄청난 노력에도 불구하고 염색질 도메인의 형성과 전파에 대한 우리의 이해는 여전히 제한적입니다. 크로마틴 도메인은 안정된 상태 조건 하에서 연구되어 왔으며, 이는 설립 기간 동안 초기 사건을 따르는 데 도움이되지 않습니다. 여기에서는 염색질 도메인을 유도적으로 재구성하고 시간의 함수로 재형성을 따르는 방법을 제시합니다. 비록, 먼저 PRC2 매개 억압 크로마틴 도메인 형성의 경우에 적용, 그것은 쉽게 다른 염색질 도메인에 적응 될 수 있었다. 유전체학 및 이미징 기술과 이 방법의 수정 및/또는 조합은 크로마틴 도메인의 설립을 매우 자세하게 연구하는 귀중한 도구를 제공할 것입니다. 우리는 이 방법이 염색질 도메인이 어떻게 형성되고 상호 작용하는지에 대한 우리의 이해에 혁명을 일으킬 것이라고 믿습니다.
진핵 게놈은 고도로 조직되고 염색질 접근성에 있는 변경은유전자 전사 1을 직접 통제합니다. 게놈은 전사 활동 및 복제 타이밍2,3와상관 관계가 있는 염색질 도메인의 명백한 모형을 포함합니다. 이러한 염색질 도메인은 몇 킬로베이스(kb)에서 100kb 이상까지 의 크기 범위이며 뚜렷한 히스톤변형 4의 농축을 특징으로 한다. 핵심 질문은 이러한 도메인이 어떻게 형성되고 어떻게 전파되는가하는 것입니다.
가장 잘 특징지어진 염색질 도메인 중 하나는 폴리콤 억압 복합체 2(PRC2)의 활성을 통해 육성된다. PRC2는단백질5,6의폴리콤 그룹(PcG)의 서브세트로 구성된 다중 소단위 복합체로, 히스톤 H3(H3K27me1/me2/me3)의 리신 27의 모노, 디-및트리메틸화를 촉매한다. 9,10. H3K27me2/me3는 억압적인 염색질 상태와 관련이 있지만 H3K27me1의 기능은불분명합니다 6,11. 중화민의 핵심 구성 요소 중 하나인 배아 외배엽 발달(EED)은, 그 방향족 케이지를 통해 PRC2 촉매, H3K27me3의 최종 생성물인 PrC212,13의알로스테릭 자극을 초래한다. PRC2 효소 활동은 특정 혈통에 대한 금기 특정 발달 유전자의 부적절한 발현으로 개발 중 세포 정체성을 보존하는데 매우 중요하며, 5, 6에 해가 될 것입니다. . 따라서, PRC2가 포유류에서 억압적인 염색질 도메인의 형성을 촉진하는 메커니즘을 해명하는 것은 세포 정체성을 이해하는 데 근본적으로 중요합니다.
PRC2 매개 염색질 도메인을 포함하여 염색질 도메인 형성을 조사하기 위해 고안된 모든 과거 실험 시스템은 염색질 도메인 형성의 전개 이벤트를 추적할 수 없는 정상 상태 조건하에서 수행되었습니다. 셀. 여기에서는 염색질 도메인의 초기 모집 및 전파를 모니터링하는 유도성 셀룰러 시스템을 생성하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 특히, 우리는 H3K27me2/3를 구성하는 PRC2 매개 억압성 염색질 도메인의 형성을 추적하는 데 중점을 둡니다. 염색질 도메인 형성의 기계적 세부 사항을 캡처할 수 있는 이 시스템은 H2AK119ub 또는 H3K9me을 포함하는 널리 연구된 도메인과 같은 다른 염색질 도메인을 통합하도록 적응될 수 있습니다. 유전체학 및 이미징 기술과 결합하여, 이 접근법은 염색질 생물학에 있는 각종, 중요한 질문을 성공적으로 해결하는 잠재력을 가지고 있습니다.
주어진 염색질 도메인의 형성 도중 기계론적인 세부사항을 이해하는 쪽으로 강력한 접근은, 먼저 도메인을 중단하고 세포 내의 진행 중인 그것의 재건을 추적하는 것입니다. 이 프로세스는 재구성 중에 언제든지 일시 중지되어 진행 중인 이벤트를 자세히 분석할 수 있습니다. 염색질 도메인에 대한 이전 연구는 정상 상태 조건(예: 야생형 및 유전자 녹아웃 비교)에서 수행되었기 때문에 이러한 이…
The authors have nothing to disclose.
엘 발레스 박사, 디 오자타 박사, 에이치 무 박사님에게 원고 개정에 감사드립니다. D.R. 연구소는 하워드 휴즈 의학 연구소와 국립 보건원 (R01CA199652 및 R01NS100897)에 의해 지원됩니다.
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
Primers/gBlocks | |||
EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
Genotyping Primers | |||
Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |