Denne metoden er utformet for å følge dannelsen av PRC2-mediert kromatin domener i cellelinjer, og metoden kan tilpasses til mange andre systemer.
Organiseringen og strukturen av kromatin domener er unike for individuelle cellelinjene. Deres misregulation kan føre til et tap i mobilnettet identitet og/eller sykdom. Til tross for enorm innsats, er vår forståelse av dannelsen og utbredelsen av kromatin domener fortsatt begrenset. Kromatin-domener har blitt studert under steady-state forhold, som ikke bidrar til å følge de første hendelsene under opprettelsen. Her presenterer vi en metode for å inducibly rekonstruere kromatin domener og følge deres re-formasjon som en funksjon av tid. Selv om, først brukt på saken av PRC2-mediert undertrykkende kromatin domene formasjon, kan det være lett tilpasses andre kromatin domener. Endringen av og/eller kombinasjonen av denne metoden med Genomics og Imaging teknologier vil gi uvurderlig verktøy for å studere etablering av kromatin domener i stor detalj. Vi tror at denne metoden vil revolusjonere vår forståelse av hvordan kromatin domener form og samhandle med hverandre.
Eukaryote genomer er svært organisert og endringer i kromatin tilgjengelighet direkte styrer gen transkripsjon1. Det Genova behersker adskilt typer av kromatin domenen, hvilke relatere med transcriptional aktivitet og Replication beregner2,3. Disse kromatin domener varierer i størrelse fra noen kilobases (KB) til mer enn 100 KB og er preget av en berikelse i distinkte histone modifikasjoner4. De sentrale spørsmålene er: hvordan er disse domenene dannet og hvordan er de spredte?
En av de mest godt preget kromatin domener er fostret gjennom aktiviteten til Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2). PRC2 er et multi-delenhet kompleks bestående av en undergruppe av Polycomb gruppen (GF) av proteiner5,6, og katalyserer mono-, di-og trimethylation av lysin 27 av histone H3 (H3K27me1/Me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 er assosiert med en undertrykkende kromatin tilstand, men funksjonen til H3K27me1 er uklart6,11. En av de viktigste komponentene i PRC2, embryonale ektoderm utvikling (EED), binder seg til sluttproduktet av PRC2 katalyse, H3K27me3, gjennom sin aromatiske buret og denne funksjonen resulterer i nukleosid stimulering av PRC212,13. Den PRC2 enzymatisk aktivitet er avgjørende for å bevare mobilnettet identitet under utvikling som upassende uttrykk for visse utviklingsmessige gener som er kontraindisert for en bestemt avstamning, ville være skadelig5,6 . Derfor unraveling mekanismene som PRC2 fremmer dannelsen av undertrykkende kromatin domener i pattedyr er av fundamental betydning for å forstå mobilnettet identitet.
Alle de siste eksperimentelle systemer utviklet for å undersøke kromatin domene formasjon inkludert PRC2-mediert kromatin domener, ble utført under steady-state forhold, som ikke er i stand til å spore de utfolder hendelsene i kromatin domene formasjon i Celler. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å generere en induserbart Cellular system som overvåker den første rekruttering og forplantning av kromatin domener. Nærmere bestemt fokuserer vi på å spore dannelsen av PRC2-mediert undertrykkende kromatin domener som omfatter H3K27me2/3. Dette systemet som kan fange opp mekanistisk detaljer om kromatin domene formasjon, kan tilpasses til å innlemme andre kromatin-domener, slik som utbredt studert domener bestående enten H2AK119ub eller H3K9me. I kombinasjon med Genomics og Imaging teknologier, denne tilnærmingen har potensial til å lykkes adresse ulike, viktige spørsmål i kromatin biologi.
En mektig tilnærming til å forstå mekanistisk detaljer under dannelsen av et gitt kromatin domene, er først å forstyrre domenet og deretter spore sin rekonstruksjon i fremgang i cellene. Prosessen kan stanses midlertidig når som helst under gjenoppbyggingen for å analysere i detalj hendelsene som pågår. Tidligere studier på kromatin domener var ikke i stand til å løse slike hendelser som de ble utført under steady-state forhold (for eksempel sammenligne vill-type og gen knockout). Her skisserer vi et system …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker DRS. L. Vales, D. Ozata og H. MoU for revisjon av manuskriptet. Den D.R. Lab støttes av Howard Hughes Medical Institute og National Institutes of Health (R01CA199652 og R01NS100897).
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
Primers/gBlocks | |||
EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
Genotyping Primers | |||
Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |