Un método para estudiar la formación de novo de dominios de cromatina
Summary
Este método está diseñado para seguir la formación de dominios de cromatina mediadas por PRC2 en líneas celulares, y el método se puede adaptar a muchos otros sistemas.
Abstract
La organización y la estructura de los dominios de cromatina son exclusivas de los linajes celulares individuales. Su mala regulación podría conducir a una pérdida en la identidad celular y / o enfermedad. A pesar de los enormes esfuerzos, nuestra comprensión de la formación y propagación de dominios de cromatina sigue siendo limitada. Los dominios de cromatina se han estudiado en condiciones estables, que no son propicias para seguir los acontecimientos iniciales durante su establecimiento. Aquí, presentamos un método para reconstruir inducibariamente dominios de cromatina y seguir su re-formación en función del tiempo. Aunque, aplicado primero al caso de la formación de dominios de cromatina represiva mediada por PRC2, podría adaptarse fácilmente a otros dominios de cromatina. La modificación y/o la combinación de este método con la genómica y las tecnologías de imagen proporcionarán herramientas invaluables para estudiar el establecimiento de dominios de cromatina con gran detalle. Creemos que este método revolucionará nuestra comprensión de cómo se forman los dominios de cromatina e interactúan entre sí.
Introduction
Los genomas eucariotas están altamente organizados y los cambios en la accesibilidad a la cromatina controlan directamente la transcripción genética1. El genoma contiene distintos tipos de dominios de cromatina, que se correlacionan con la actividad transcripcional y la sincronización de replicación2,3. Estos dominios de cromatina varían en tamaño de unas pocas kilobases (kb) a más de 100 kb y se caracterizan por un enriquecimiento en distintas modificaciones histonas4. Las preguntas centrales son: ¿cómo se forman estos dominios y cómo se propagan?
Uno de los dominios de cromatina más bien caracterizados se fomenta a través de la actividad del complejo represivo 2 (PRC2). PRC2 es un complejo multisubunidad compuesto por un subconjunto del Grupo Polycomb (PcG) de proteínas5,6, y cataliza la mono-, di- y trimetilación de lisina 27 de histona H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 están asociados con un estado de cromatina represiva, pero la función de H3K27me1 no está clara6,11. Uno de los componentes principales de PRC2, el desarrollo embrionario de ectodermos (EED), se une al producto final de la catálisis PRC2, H3K27me3, a través de su jaula aromática y esta característica da como resultado la estimulación alostérica de PRC212,13. La actividad enzimática PRC2 es crucial para preservar la identidad celular durante el desarrollo, ya que la expresión inapropiada de ciertos genes del desarrollo que están contraindicados para un linaje específico, sería perjudicial5,6 . Por lo tanto, desentrañar los mecanismos por los cuales PRC2 fomenta la formación de dominios represivas de cromatina en los mamíferos es de importancia fundamental para entender la identidad celular.
Todos los sistemas experimentales anteriores diseñados para investigar la formación de dominios de cromatina, incluidos los dominios de cromatina mediados por PRC2, se realizaron en condiciones de estado estacionario, que no pueden rastrear los eventos de formación de dominios de cromatina en Células. Aquí, presentamos un protocolo detallado para generar un sistema celular inducible que monitorea el reclutamiento inicial y la propagación de dominios de cromatina. Específicamente, nos centramos en el seguimiento de la formación de dominios de cromatina represiva mediados por PRC2 que comprenden H3K27me2/3. Este sistema que puede capturar los detalles mecanicistas de la formación de dominios de cromatina, podría adaptarse para incorporar otros dominios de cromatina, como los dominios ampliamente estudiados que comprenden H2AK119ub o H3K9me. En combinación con la genómica y las tecnologías de imagen, este enfoque tiene el potencial de abordar con éxito varias cuestiones clave en la biología de la cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un enfoque poderoso hacia la comprensión de los detalles mecanicistas durante la formación de un dominio de cromatina dado, es primero interrumpir el dominio y luego realizar un seguimiento de su reconstrucción en curso dentro de las células. El proceso se puede pausar en cualquier momento durante la reconstrucción para analizar en detalle los eventos en curso. Estudios previos sobre dominios de cromatina no pudieron resolver tales eventos, ya que se realizaron en condiciones de estado estacionario (por ejemplo, com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los doctores L. Vales, D. Ozata y H. Mou por la revisión del manuscrito. El D.R. Lab cuenta con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes y los Institutos Nacionales de Salud (R01CA199652 y R01NS100897).
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
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