Denna metod är utformad för att följa bildandet av PRC2-medierade kromatin domäner i cellinjer, och metoden kan anpassas till många andra system.
Organisationen och strukturen av kromatin domäner är unika för enskilda celllineages. Deras felaktig kan leda till en förlust i cellulära identitet och/eller sjukdom. Trots enorma ansträngningar, vår förståelse av bildandet och spridningen av kromatin domäner är fortfarande begränsad. Kromatin domäner har studerats under steady-state villkor, som inte bidrar till att följa de inledande händelserna under sin etablering. Här presenterar vi en metod för att inducibly rekonstruera kromatin domäner och följa deras re-formation som en funktion av tiden. Även om, först tillämpas på fallet med PRC2-medierade repressiva kromatin domän formation, det kan lätt anpassas till andra kromatin domäner. Modifieringen av och/eller kombinationen av denna metod med Genomics och Imaging Technologies kommer att ge ovärderliga verktyg för att studera inrättandet av kromatin domäner i detalj. Vi tror att denna metod kommer att revolutionera vår förståelse för hur kromatin domäner form och interagera med varandra.
Eukaryota genom är mycket organiserad och förändringar i kromatin Accessibility direkt styr gentranskription1. Genomet innehåller olika typer av kromatin domäner, som korrelerar med transkriptionell aktivitet och replikering timing2,3. Dessa kromatin domäner varierar i storlek från några kilobases (KB) till mer än 100 KB och kännetecknas av en berikning i distinkta Histon ändringar4. De centrala frågorna är: hur bildas dessa domäner och hur sprids de?
En av de mest välkarakteriserade kromatin domänerna främjas genom aktiviteten av Polycomb repressiva Complex 2 (PRC2). PRC2 är en multi-subunit komplex består av en delmängd av polycomb gruppen (PCG) av proteiner5,6, och katalyserar mono-, di-och trimetylering av lysin 27 av Histon H3 (H3K27me1/ME2/ME3)7,8, 9,10. H3K27me2/ME3 är förknippade med en repressiv kromatin tillstånd, men funktionen av H3K27me1 är oklart6,11. En av de viktigaste komponenterna i PRC2, embryonal ektoderm utveckling (Eed), binder till slutprodukten av PRC2 katalys, H3K27me3, genom sin aromatiska bur och denna funktion resulterar i Alloster stimulering av PRC212,13. Den PRC2 enzymatiska aktiviteten är avgörande för att bevara cellulära identitet under utvecklingen som olämpligt uttryck för vissa utvecklingsgener som är kontraindicerat för en viss härstamning, skulle vara skadligt5,6 . Därför, reda ut de mekanismer genom vilka PRC2 främjar bildandet av repressiva kromatin domäner hos däggdjur är av grundläggande betydelse för att förstå cellulära identitet.
Alla de tidigare experimentella system för att undersöka kromatin domän formation inklusive PRC2-medierad kromatin domäner, utfördes under steady-state villkor, som inte kan spåra de pågående händelserna i kromatin domän formation i Celler. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att generera en inducerbara cellulära system som övervakar den inledande rekryteringen och spridningen av kromatin domäner. Specifikt fokuserar vi på att spåra bildandet av PRC2-medierade repressiva kromatin domäner som utgör H3K27me2/3. Detta system som kan fånga de mekanistiska detaljerna i kromatin domän formation, kan anpassas för att införliva andra kromatin domäner, såsom de allmänt studerade domäner som omfattar antingen H2AK119ub eller H3K9me. I kombination med genomik och Imaging Technologies, denna strategi har potential att framgångsrikt ta itu med olika, viktiga frågor i kromatin biologi.
En kraftfull strategi för att förstå de mekanistiska detaljerna under bildandet av en given kromatin domän, är att först störa domänen och sedan spåra dess återuppbyggnad pågår inom celler. Processen kan pausas när som helst under återuppbyggnaden för att analysera i detalj de händelser som pågår. Tidigare studier på kromatin domäner kunde inte lösa sådana händelser som de utfördes under steady-state villkor (t. ex., jämföra Wild-typ och Gene knockout). Här skisserar vi ett system för att bed?…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar DRS. L. Vales, D. OZATA och H. MOU för revidering av manuskriptet. Den D.R. Lab stöds av Howard Hughes Medical Institute och National Institutes of Health (R01CA199652 och R01NS100897).
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
Primers/gBlocks | |||
EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
Genotyping Primers | |||
Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |