Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi
Summary
Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.
Abstract
Kromatin etki alanlarının organizasyonu ve yapısı tek tek hücre soylarına özgüdür. Onların yanlış regülasyonu hücresel kimlik ve / veya hastalık kaybına yol açabilir. Muazzam çabalara rağmen, kromatin alanlarının oluşumu ve yayılması anlayışımız hala sınırlıdır. Kromatin etki alanları, kuruluşları sırasında ki ilk olayları takip etmeye elverişli olmayan sabit devlet koşullarında incelenmiştir. Burada, kromatin etki alanlarını inducibly yeniden inşa etmek ve zamanın bir fonksiyonu olarak yeniden oluşumunu takip etmek için bir yöntem salıyoruz. Her ne kadar ilk olarak ÇHC2 aracılı baskılayıcı kromatin etki alanı oluşumu olgusuna uygulansa da, diğer kromatin etki adlarına kolayca adapte edilebilir. Bu yöntemin genomik ve görüntüleme teknolojileri ile değiştirilmesi ve/veya kombinasyonu, kromatin alanlarının kurulmasını ayrıntılı olarak incelemek için paha biçilmez araçlar sağlayacaktır. Bu yöntemin kromatin alanlarının nasıl oluştuğu ve birbirleriyle nasıl etkileşimde olduğu anlayışımızda devrim olacağına inanıyoruz.
Introduction
Ökaryotik genomlar son derece organize ve kromatin erişilebilirlik değişiklikleri doğrudan gen transkripsiyonkontrol 1. Genom transkripsiyonel aktivite ve çoğaltma zamanlaması2,3ile ilişkili kromatin etki alanları, farklı türleri içerir. Bu kromatin etki alanları boyutu birkaç kilobases (kb) fazla 100 kb arasında değişir ve farklı histon modifikasyonları bir zenginleştirme ile karakterizedir4. Temel sorular şunlardır: bu etki alanları nasıl oluşur ve nasıl yayılır?
En iyi karakterize kromatin etki alanlarından biri Polycomb baskıcı kompleks 2 (PRC2) aktivitesi ile teşvik edilir. PRC2, Polycomb Group ‘un (PcG)5,6proteinlerinin bir alt kümesinden oluşan ve histon H3 (H3K27me1/me2/me3) 27 lisenin mono-, di-ve trimethylation katalizler bir çok alt birim kompleksidir 7,8, 9,10. H3K27me2/me3 baskıcı kromatin durumu ile ilişkilidir, ancak H3K27me1 fonksiyonu belirsiz6,11. ÇHC2 temel bileşenlerinden biri, embriyonik ektoderm gelişimi (EED), çHC2 kataliz son ürün bağlanır, H3K27me3, aromatik kafes aracılığıyla ve bu özellik PRC2 allosteric stimülasyon sonuçları12,13. ÇHC2 enzimatik aktivitesi belirli bir soy için kontrendike olan bazı gelişimsel genlerin uygunsuz ifadesi olarak gelişim sırasında hücresel kimliğin korunması için çok önemlidir, zararlı olacaktır5,6 . Bu nedenle, PrC2’nin memelilerde baskıcı kromatin alanlarının oluşumunu teşvik ettiği mekanizmaların çözülmesi hücresel kimliğin anlaşılması için temel öneme sahiptir.
PrC2 aracılı kromatin etki alanları da dahil olmak üzere kromatin etki alanı oluşumunu araştırmak için tasarlanmış tüm deneysel sistemler, kromatin etki alanı oluşumunun gelişen olaylarını takip edemeyen sabit durum koşullarında gerçekleştirilmiştir. Hücre. Burada, kromatin alanadlarının ilk işe alımını ve yayılmasını izleyen indüklenebilir bir hücresel sistem oluşturmak için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Özellikle, H3K27me2/3’ü oluşturan ÇHC2 aracılı baskıcı kromatin etki alanlarının oluşumunu izlemeye odaklanıyoruz. Kromatin etki alanı oluşumunun mekanistik ayrıntılarını yakalayabilen bu sistem, H2AK119ub veya H3K9me’den oluşan yaygın olarak çalışılan etki alanları gibi diğer kromatin etki alanlarını da dahil etmek üzere uyarlanabilir. Genomik ve görüntüleme teknolojileri ile birlikte, bu yaklaşım kromatin biyolojisindeki çeşitli önemli soruları başarılı bir şekilde ele alma potansiyeline sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belirli bir kromatin etki alanının oluşumu sırasında mekanistik ayrıntıları anlamak için güçlü bir yaklaşım, ilk etki alanı bozmak ve daha sonra hücreler içinde devam eden yeniden izlemedir. Devam eden olayları ayrıntılı olarak analiz etmek için yeniden yapılanma sırasında herhangi bir zamanda duraklatılmış olabilir. Kromatin etki alanları üzerinde daha önce yapılan çalışmalar, bu tür olayları sabit durum koşullarında (örneğin, yabani tip ve gen nakavtı karşılaştırması) ger?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. L. Vales, D. Ozata ve H. Mou’ya makalenin revizyonu için teşekkür ederiz. D.R. Lab, Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01CA199652 ve R01NS100897) tarafından desteklenir.
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
- Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
- Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
- Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
- Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
- Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
- Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
- Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
- Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
- Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
- Benchling for Academics. Benchling Available from: https://benchling.com (2018)
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
- Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- . UCSC Genome Browser Home Available from: https://genome.ucsc.edu (2019)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
- Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).
