حمل التهاب السحايا السحائي Serogroup C في الفئران عن طريق تسليم إينتراسيستيرنال
Summary
هنا ، ونحن وصف طريقه للحث علي التهاب السحايا المكورات السحائية من خلال طريق إينتراسيستيرنال من العدوى في الفئران الكبار. نقدم بروتوكول خطوه بخطوه للعدوى بالمكورات السحائية من اعداد الاصابه بالعدوى الإينتراسيستيرناله. ثم تسجيل البقاء علي قيد الحياة الحيوانية وتقييم الأحمال البكتيرية في الانسجه murine.
Abstract
Neisseria النيسريه (المكورات السحائية) هي كائنات مجهريه ضيقه النطاق ، معترف بها عالميا باعتبارها السبب الرئيسي للتهاب السحايا البكتيري. المكورات السحائية هو مستعمر عابر من البلعوم الأنفي البشري من حوالي 10 ٪ من المادة الصحية. في الظروف الخاصة ، فانه يكتسب قدره الغازية لاختراق الحاجز المخاطي ويغزو مجري الدم المسببة لمرض التسمم الدموي. في الحالة الاخيره ، يمكن ان ينشا تعفن الانتان حتى بدون التطور الناتج عن التهاب السحايا. وعلي العكس من ذلك ، يمكن ان تتكاثر البكتيريا بشكل سيئ في مجري الدم ، وعبور حاجز الدماغ الدموي ، والوصول إلى الجهاز العصبي المركزي ، مما يؤدي إلى التهاب السحايا الجرثومي. نماذج murine من التهاب السحايا البكتيري تمثل أداه مفيده للتحقيق في التفاعلات بين المضيف والممرض وتحليل أليات المرضية المسؤولة عن هذا المرض المميت. علي الرغم من انه تم تقييم عده أنظمه نموذجيه تجريبية علي مدي العقود الماضية ، لم يتمكن اي منها من أعاده إنتاج الاحداث المرضية المميزة لمرض المكورات السحائية. في هذا البروتوكول التجريبي ، ونحن وصف اجراء مفصل لتحريض التهاب السحايا المكورة السحائية في نموذج الماوس علي أساس التلقيح إينتراسيستيرنال من البكتيريا. وسجلت علامات غريبه من التهاب السحايا البشري في المضيف murine من خلال تقييم المعلمات السريرية (مثل درجه الحرارة ، ووزن الجسم) ، وتقييم معدل البقاء علي قيد الحياة ، والتحليل الميكروبيولوجي والفحص النسيجي للاصابه بالمخ. عند استخدام إينتراسيستيرنال (ط. cist.) المكورات السحائية ، وتسليم كامله مباشره فيماجنا سينسينا ، مما يؤدي إلى النسخ المتماثل المكورات السحائية فعاله جدا في انسجه المخ. لوحظت زيادة 1,000 اضعاف العد القابل للحياة من البكتيريا في حوالي 18 ح. وعلاوة علي ذلك ، توجد أيضا المكورات السحائية في الطحال ، والكبد من الفئران المصابة ، مما يوحي بان الكبد قد تمثل الجهاز المستهدف للنسخ المتماثل المكورات السحائية.
Introduction
Neisseria النيسريه هو غرام السلبية β-بروتينيه تقتصر علي الإنسان المضيف ، والمعروف جيدا لكونها واحده من الأسباب الأكثر شيوعا للتهاب السحايا والانتان في السكان البشرية في جميع انحاء العالم. فانه استعمار الجهاز التنفسي العلوي (الأنف والحنجرة) من ناقلات صحية وغير متناظرة (2-30 ٪ من السكان) ، ولكن البكتيريا في بعض الأحيان يفادس الدفاعات المناعية المضيف المختلفة وينتشر من مجري الدم إلى الدماغ مما تسبب في المحلية غير المنضبط التهاب ، والمعروفة باسم السحايا المكورات السحائية. مزيج من العوامل المضيفة والبكتيرية يبدو ان المساهمة في الانتقال من المعلق إلى السلوك الغازي1.
النيسريه متخصصة حصرا في الاستعمار البشري والعدوى. لديها مجموعه ضيقه المضيف ، التالي ، قد محدوده في الدراسات التي تولد الجسم البشري بسبب عدم وجود نماذج الحيوانية المناسبة التي تتكاثر مرض المكورات السحائية الإنسان. ونتيجة لذلك ، ادي ذلك إلى ثغرات أساسيه في الفهم فيما يتعلق بالتسبب في تسمم الدم والتهاب السحايا الناجم عن المكورات السحائية. وفي العقود الاخيره ، سمح تطوير العديد من النظم المختبرية بتحديد العديد من عوامل المكورات السحائية2،3،4. علي الرغم من ان هذه الدراسات القيمة قدمت رؤى هامه لفهم دور هذه العوامل لعدوي المكورات السحائية ناجحه ، وهذه النماذج لا تسمح بتقييم عواقب التفاعلات البكتيرية مع الخلطيه والخلوية الجهاز المناعي وحتى اقل مع الانسجه كلها. في الكائنات الحيوانية نماذج العدوى هي ذات اهميه كبيره ، وكذلك لتقييم درجه الحماية التي تمنحها تركيبات اللقاح. وبوصفها من العوامل المسببة للمرض البشري ، فان المكورات السحائية تمتلك محددات مناسبه ضرورية للعدوى الناجحة مثل الهياكل السطحية (اي النوع الرابع وبروتينات التعتيم) وأنظمه امتصاص الحديد للمستقبلات البشرية وبروتينات النقل (اي ترانسفيرين و lactoferrin)5،6،7 للتقيد بشكل صحيح ، والبقاء علي قيد الحياة وغزو المضيف البشري. وأخيرا ، فان قدرات التباين الجيني للمرض للتهرب و/أو منع الاستجابة المناعية البشرية تساهم بشكل أكبر في الأنواع العالية من تروسم8،9. ولذلك ، فان عدم وجود عوامل مضيفه محدده ، تشارك في التفاعل ، يمكن ان يعرقل خطوات دوره حياه الممرض ، مما ينشئ صعوبات كبيره في تطوير نماذج حيوانيه صغيره تلخص دوره حياه المكورات السحائية.
علي مدي العقود الماضية ، تم تطوير العديد من النهج لتحسين فهمنا للدورة المعدية المكورات السحائية. وقد وضعت التهابات نموذجين الحيوانية والماوس والفئران ، اما داخل الصفاق (i.p.) أو الإنترانت (ا) ، لإنتاج مرض المكورات السحائية10،11،12،13،14 ،15،16،17. الماوس المختبر هو علي الأرجح واحده من أكثر تنوعا الحيوانية للحث علي العدوى المكورة السحائية التجريبية.
ومع ذلك ، فان الطريقة الi.p.ه للعدوى تؤدي إلى تطور الانتان الحاد علي الرغم من انه لا يحاكي الطريق الطبيعي للعدوى ، في حين ان الطريق الا للعدوى كان مفيدا لتقييم الاصابه بالتهاب المكورات السحائية ، علي الرغم من انه قد يسبب عدوي الرئة قبل الانتان10،11،12،13،14،15،16،17.
وكان نموذج الماوس i.p. مفيده لتقييم الحماية من المكورات السحائية التحدي10،11،12. وقد تم تطوير نموذج الماوس للاستعمار المكورات السحائية علي أساس المسار الا للعدوى مع الفئران الرضع ، لأنها أكثر عرضه للاصابه بالمكورات السحائية ، لأعاده إنتاج عدوي الغازية محاكاة مسار مرض المكورات السحائية في البشر 13،14،15،16،17. وعلاوة علي ذلك ، لتعزيز تكرار المكورات السحائية في المضيف murine ، تم أيضا تطبيق عدد متزايد من الاستراتيجيات التقنية بما في ذلك أداره الحديد للحيوانات لتحسين العدوى ، واستخدام البكتيريا البكتيرية عاليه ، الماوس-المرور البكتيرية سلاله وكذلك توظيف الرضع أو المناعية الحيوانية يستضيف10،13،15،18،19. التعبير عن العوامل البشرية المحددة مثل CD4620 أو ترانسفيرين21 قد زاد من قابليه الفئران لهذه البكتيريا البشرية المدارية ؛ وقد كان العمل من نموذج الجلد الإنسان طعم الغيروي العدوى مفيده أيضا لتقييم قدره التصاق المكورات السحائية إلى الإنسان بطانة22,23. وبشكل جماعي ، ادي التطور الأخير في الفئران المحورة وراثيا إلى تحسين فهم تولد التهاب السحائي وتفاعلاته المضيفة.
في السابق ، وضعنا نموذج murine من التهاب السحايا المكورات السحائية حيث تم اجراء تلقيح البكتيريا في ماجنا السينية من الفئران الكبار مع الماوس-البكتيريا التي تمر بالفار24. المعلمات السريرية ومعدل البقاء علي قيد الحياة من الفئران المصابة أظهرت إنشاء التهاب السحايا مع خصائص مماثله لتلك التي ينظر اليها في المضيف البشري ، فضلا عن التحليلات الميكروبيولوجية والنسيجية للدماغ. من هذه الفئران المصابة, وكانت البكتيريا, أيضا, تعافي من الدم, الكبد, والطحال, والأحمال البكتيرية من الاجهزه الطرفية ترتبط مع الجرعة المعدية. وعلي وجه الخصوص ، استخدم هذا النموذج لتقييم ضراوة سلاله متحولة ايزوتون معيبه في الناقل L-الغلوتامات GltT24. في الاونه الاخيره ، وذلك باستخدام نموذج الماوس لدينا من التهاب السحايا المكورات السحائية علي أساس ط. cist. الطريق مع زمره C سلاله 93/42862،24 ومتحولة ايزوتون معيبه في ترميز الجينات شامل في اطار ل UDP-N-اسيتيل 2-epimerase25، لقد حللنا دور حمض السياليك المكشوفة في إنشاء من المرض في الفئران.
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه واضحة للحث علي التهاب السحايا المكورة السحائية التجريبية علي أساس i. cist. طريق العدوى في الفئران الكبار Balb/c. هذا الأسلوب مفيد بشكل خاص لتوصيف عدوي المكورات السحائية في المضيف murine ، وكذلك لتقييم ضراوة بين سلالات النوع البرية المرجعية والمسوخ المتحولة. ويضمن المسار الداخلي للعدوى الولادة الكاملة لمكورات السحايا مباشره في ماجنا ، والتي بدورها تسهل النسخ البكتيري في السائل النخاعي (الدماغي الشوكي) ويحفز التهاب السحايا مع الميزات التي تحاكي تلك حاضره في أناس2,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، ونحن وصف بروتوكول تجريبي للحث علي التهاب السحايا المكورات السحائية في الفئران الكبار من قبل i. cist. تلقيح بكتيريا المكورات السحائية. علي حد علمنا ، لم يتم تطوير اي نموذج آخر من التهاب السحايا المكورات السحائية في الفئران المختبرات المصابة بواسطة i. cist. طريق في الماضي ، وقد تم …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم الدراسات جزئيا بواسطة PRIN 2012 [منح عدد 2012WJSX8K]: “نماذج التفاعل المضيف microbe في التهابات المخاطية: تطوير استراتيجيات علاجيه جديده” وبواسطة PRIN 2017 [2017SFBFER]: “نهج متكامل لمعالجه التفاعل بين التكيف ، والظروف المجهدة ومقاومه مضادات الميكروبات من مسببات الامراض الصعبة “.
Materials
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
| BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
References
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 – Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
