यहां, हम वयस्क चूहों में संक्रमण के एक intracisternal मार्ग के माध्यम से मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन. हम intracisternal संक्रमण के लिए inoculum की तैयारी से मेनिंगोकोकल संक्रमण के कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम पेश; फिर पशु अस्तित्व रिकॉर्ड और murine ऊतकों में जीवाणु भार का मूल्यांकन.
नेसेरिया मेनिंगिटिस (मेनिंगोकोकस) एक संकीर्ण मेजबान-रेंज सूक्ष्मजीव है, जिसे विश्व स्तर पर बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस के प्रमुख कारण के रूप में मान्यता प्राप्त है। मेनिंगोकोकस स्वस्थ विषय के लगभग 10% के मानव नासोफैरिक्स का एक क्षणिक कॉलोनाइजर है। विशेष परिस्थितियों में, यह mucosal बाधा घुसना करने के लिए एक आक्रामक क्षमता प्राप्त करता है और सेप्टिकेमिया के कारण खून पर आक्रमण. नवीनतम मामले में, मैनिजिनाइटिस के परिणामी विकास के बिना भी फुलमिनिंग सेप्सिस उत्पन्न हो सकता है। इसके विपरीत, बैक्टीरिया खराब खून में गुणा कर सकता है, रक्त मस्तिष्क बाधा पार, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र तक पहुँचने, fulminant दिमागी शोहकरने के लिए अग्रणी. बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस के murine मॉडल मेजबान-रोगजनक बातचीत की जांच करने के लिए और इस घातक बीमारी के लिए जिम्मेदार रोगजनक तंत्र का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, कई प्रयोगात्मक मॉडल प्रणालियों पिछले दशकों में मूल्यांकन किया गया है, इनमें से कोई भी मेनिंगोकोकल रोग की विशेषता रोग घटनाओं को पुन: पेश करने में सक्षम थे. इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में, हम बैक्टीरिया के intracisternal टीका के आधार पर एक माउस मॉडल में मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस के प्रेरण के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन. मानव मैनिंजाइटिस के अजीब संकेत नैदानिक मापदंडों (जैसे, तापमान, शरीर के वजन), जीवित रहने की दर का मूल्यांकन, सूक्ष्मजीवी विश्लेषण और मस्तिष्क की चोट की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा के आकलन के माध्यम से murine मेजबान में दर्ज किए गए थे। intracisternal (i.cist.) inoculum का उपयोग करते समय, मेनिंगोकोसी पूर्ण वितरण सीधे सिस्टर्ना मैग्नामें, मस्तिष्क के ऊतकों में एक बहुत ही कुशल मेनिंगोकोकल प्रतिकृति के लिए अग्रणी। लगभग 18 ज में बैक्टीरिया की व्यवहार्य संख्या में 1,000 गुना वृद्धि देखी गई है। इसके अलावा, मेनिंगोकोसी भी तिल्ली में पाए जाते हैं, और संक्रमित चूहों के जिगर, सुझाव है कि जिगर मेनिंगोकोकल प्रतिकृति के लिए एक लक्ष्य अंग का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं.
नेसेरिया मेनिंगिटिस एक ग्राम नकारात्मक है – प्रोटीओबैक्टीरियम मानव मेजबान तक ही सीमित है, जो दुनिया भर में मानव आबादी में मेनिनजाइटिस और सेप्सिस के सबसे आम कारणों में से एक होने के लिए जाना जाता है। यह स्वस्थ और स्पर्शोन्मुख वाहक (2-30% आबादी) के ऊपरी श्वसन पथ (नोज और गले) को उपनिवेश करता है, लेकिन जीवाणु कभी-कभी विभिन्न मेजबान प्रतिरक्षा सुरक्षा से बच जाता है और खून से मस्तिष्क तक फैलता है जिससे एक अनियंत्रित स्थानीय सूजन, मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस के रूप में जाना जाता है। मेजबान और जीवाणु कारकों का एक संयोजन आक्रामक व्यवहार1को commensal से संक्रमण के लिए योगदान करने के लिए प्रकट होता है.
एन मेनिंगटिडिस विशेष रूप से मानव उपनिवेशन और संक्रमण में विशेष है। यह एक संकीर्ण मेजबान रेंज है और, इसलिए, मानव मेनिंगोकोकल रोग को पुन: उत्पन्न करने वाले उपयुक्त पशु मॉडल की कमी के कारण विवो रोगजनन अध्ययन में सीमित है। नतीजतन, यह मेनिंगोकोकस के कारण सेप्टिकेमिया और मेनिनजाइटिस के रोगजनन से संबंधित समझ में बुनियादी अंतराल के लिए नेतृत्व किया था। पिछले दशकों में , कई इन विट्रो प्रणालियों के विकास ने कई मेनिंगोकोकल उग्रता कारकों की पहचान की अनुमति दी2,3,4. हालांकि इन मूल्यवान अध्ययन एक सफल मेनिंगोकोकल संक्रमण के लिए इन कारकों की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की, इन मॉडलों हास्य और सेलुलर के साथ जीवाणु बातचीत के परिणामों के आकलन की अनुमति नहीं दी प्रतिरक्षा प्रणाली और पूरे ऊतक के साथ भी कम. विवो पशु में संक्रमण के मॉडल महान प्रासंगिकता के रूप में अच्छी तरह से टीका योगों द्वारा प्रदत्त संरक्षण की डिग्री के मूल्यांकन के लिए कर रहे हैं. एक मानव-उष्णकटिबंधीय रोगजनक के रूप में, मेनिंगोकोकस में सतह संरचनाओं (यानी, टाइप IV पिली और अस्पष्टता प्रोटीन) और मानव रिसेप्टर्स और परिवहन प्रोटीन के लिए लोहे की तेज प्रणाली जैसे सफल संक्रमण के लिए आवश्यक उचित निर्धारक ों का अधिकारी होता है (यानी, transferrin और lactoferrin)5,6,7 ठीक से पालन करने के लिए, जीवित है और मानव मेजबान पर आक्रमण. अंत में, रोगज़नक़ की आनुवंशिक भिन्नता क्षमताओं से बचने के लिए और / या मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ब्लॉक आगे उच्च प्रजातियों tropism8,9के लिए योगदान . इसलिए, विशिष्ट मेजबान कारकों की अनुपस्थिति, बातचीत में शामिल, रोगजनक के जीवन चक्र के चरणों को ब्लॉक कर सकती है, मेनिंगोकोकल जीवन चक्र का सारांश देने वाले छोटे पशु मॉडलों के विकास में महत्वपूर्ण कठिनाइयों को स्थापित कर सकती है।
पिछले दशकों में, मेनिंगोकोकल संक्रामक चक्र की हमारी समझ में सुधार करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। दो पशु मॉडल, माउस और चूहे के संक्रमण, या तो इंट्रापेरिटोनली (आई.पी.) या अंत:प्र.) (i.n.), मेनिंगोकोकल रोग10,11,12,13,14 को पुन: उत्पन्न करने के लिए विकसित किए गए थे ,15,16,17. प्रयोगशाला माउस शायद प्रयोगात्मक मेनिंगोकोकल संक्रमण को प्रेरित करने के लिए अधिक बहुमुखी जानवरों में से एक है।
हालांकि, संक्रमण का आई.पी. तरीका गंभीर सेप्सिस के विकास की ओर जाता है, हालांकि यह संक्रमण के प्राकृतिक मार्ग की नकल नहीं करता है, जबकि संक्रमण का आई.एन. मार्ग मेनिंगोकोकल रोगजनन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी था, भले ही यह फेफड़ों के संक्रमण को प्रेरित कर सकता है सेप्सिस से पहले10,11,12,13,14, 15,16,17.
आई . पी . माउस मॉडल ने मेनिंगोकोकल चैलेंज10,11,12से सुरक्षा का आकलन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी . संक्रमण के i.n. मार्ग पर आधारित मेनिंगोकोकल उपनिवेशन के माउस मॉडल शिशु चूहों के साथ विकसित किया गया है, क्योंकि वे मेनिंगोकोकी के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, मनुष्यों में मेनिंगोकोकल रोग के पाठ्यक्रम की नकल करने वाले एक आक्रामक संक्रमण को पुन: पेश करने के लिए 13,14,15,16,17. इसके अलावा, murine मेजबान में मेनिंगोकोकल प्रतिकृति को बढ़ावा देने के लिए, संक्रमण में सुधार करने के लिए जानवरों के लिए लोहे के प्रशासन सहित तकनीकी रणनीतियों की बढ़ती संख्या भी लागू की गई, उच्च जीवाणु inoculumके उपयोग , चूहे से गुजरने वाले जीवाणु तनाव के साथ-साथ शिशु या प्रतिरक्षा पशु के रोजगार के लिए10,13,15,18,19की मेजबानी की जाती है । CD4620 या transferrin21 जैसे विशिष्ट मानव कारकों की अभिव्यक्ति इस मानव-tropic जीवाणु के लिए चूहों की संवेदनशीलता में वृद्धि हुई है; संक्रमण के मानव त्वचा xenograft मॉडल का रोजगार भी मानव endothelium22,23के लिए meningococi के आसंजन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी रहा है . सामूहिक रूप से, मानवीकृत ट्रांसजेनिक चूहों के हाल के विकास ने मेनिंगोकोकल रोगजनन और इसके मेजबान बातचीत की समझ में सुधार किया है।
इससे पहले, हमने मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस का एक मौरीन मॉडल विकसित किया था जहां चूहे-पास ्डजीवाणुओंके साथ वयस्क चूहों के कुंडमें में बैक्टीरिया का टीका लगाया गया था। नैदानिक मानकों और संक्रमित चूहों के जीवित रहने की दर मानव मेजबान में देखा उन लोगों के लिए तुलनीय विशेषताओं के साथ दिमागी पनकी की स्थापना का प्रदर्शन किया, साथ ही, मस्तिष्क के सूक्ष्मजीवी और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण. इन संक्रमित चूहों से, बैक्टीरिया, भी, रक्त, जिगर, और तिल्ली से बरामद किया गया, और परिधीय अंगों से जीवाणु भार संक्रामक खुराक के साथ सहसंबद्ध. विशेष रूप से, इस मॉडल को एल-ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर GltT24में दोषपूर्ण एक isogenic उत्परिवर्ती तनाव की उग्रता का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया गया था। हाल ही में, आई.सी.टी. के आधार पर मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस के हमारे माउस मॉडल का उपयोग करना। सीरोग्रुप सी तनाव के साथ मार्ग 93/42862,24 और एक isogenic उत्परिवर्ती यूडीपी के लिए सीएसए जीन एन्कोडिंग में दोषपूर्ण-एन-एसिटिलग्लूकोसामाइन 2-एपिमेरेज़25, हम स्थापना में उजागर sialic एसिड की भूमिका का विश्लेषण किया है चूहों में रोग की.
इस प्रोटोकॉल में, हम i.cist के आधार पर प्रयोगात्मक मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस प्रेरित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। Balb/c वयस्क चूहों में संक्रमण का मार्ग. यह विधि विशेष रूप से एक murine मेजबान में मेनिंगोकोकल संक्रमण की विशेषता के लिए उपयोगी है, साथ ही जंगली प्रकार संदर्भ उपभेदों और isogenic उत्परिवर्ती के बीच उग्रता के आकलन के लिए. संक्रमण का इंट्रा-सिस्टरल मार्ग सीधे सिस्टर्ना मैग्ना में मेनिंगोकोसी की पूरी डिलीवरी सुनिश्चित करता है, जो बदले में मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में जीवाणु प्रतिकृति की सुविधा प्रदान करता है और मेनिनजाइटिस को उन विशेषताओं के साथ प्रेरित करता है जो उन की नकल करते हैं। मनुष्यों में वर्तमान2,24,25,26.
इस अध्ययन में, हम i.cist द्वारा वयस्क चूहों में मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस प्रेरित करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। मेनिंगोकोकल बैक्टीरिया का टीका. हमारी जानकारी के अनुसार, आई.सी.सी. द…
The authors have nothing to disclose.
अध्ययन PRIN द्वारा भाग में समर्थित थे 2012 [अनुदान संख्या 2012WJSX8K]: “होस्ट-माइक्रोब बातचीत मॉडल mucosal संक्रमण में: उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों का विकास” और PRIN द्वारा 2017 [2017SFBFER]: “एक एकीकृत दृष्टिकोण के बीच परस्पर क्रिया से निपटने के लिए अनुकूलन, तनावपूर्ण स्थितियों और चुनौतीपूर्ण रोगजनकों के एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध”।
1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
GC agar base | OXOID | CM0367 | |
Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
Ketamine | Intervet | ||
Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
Xylazine | Intervet |