Forbedring af nøjagtigheden af strømnings Cytometrisk vurdering af mitokondriel membran potentiale i hæmatopoietisk stamceller og Progenitorcellerne gennem hæmning af efflux-pumper
Summary
Xenobiotiske effluks pumper er meget aktive i hæmatopoietisk stilk og progenitorceller (hspc’er) og forårsage ekstrudering af tmrm, en mitokondriel membran potentielle fluorescerende farvestof. Her præsenterer vi en protokol til præcist at måle mitokondrie membran potentiale i hspcs af tmrm i nærværelse af verapamil, en effluks pumpe hæmmer.
Abstract
Da cellulær metabolisme er en central regulator af hæmatopoietisk stamcelle (HSC) selvfornyelse, er de forskellige roller, der spilles af mitokondrierne i hæmatopoietisk homøostase, blevet grundigt undersøgt af HSC-forskere. Mitokondrie aktivitetsniveauer afspejles i deres membran potentialer (ΔΨm), som kan måles ved celle-permente kationiske farvestoffer såsom TMRM (tetramethylrhodamin, methylester). Effluks-pumpernes evne til at ekstrudere disse farvestoffer fra celler kan dog begrænse deres anvendelighed. Den resulterende måle skævhed er særlig kritisk ved vurdering af HSCs, da xenobiotiske transportører udviser højere udtryks-og aktivitetsniveauer i HSCs end i differentierede celler. Her beskriver vi en protokol, der udnytter verapamil, en effluks-pumpe hæmmer, til nøjagtigt at måle ΔΨm på tværs af flere knoglemarvs populationer. Den resulterende hæmning af pumpe aktivitet viser sig at øge TMRM-intensiteten i hæmatopoietisk stamceller og progenitorcellerne (Hspc’er), samtidig med at den forbliver relativt uændret i modne fraktioner. Dette fremhæver den tætte opmærksomhed på Dye-efflux aktivitet, der er nødvendig, når ΔΨm-afhængige farvestoffer anvendes, og som skrevet og visualiseret, denne protokol kan bruges til præcist at sammenligne enten forskellige populationer i knoglemarven, eller den samme population på tværs af forskellige eksperimentelle modeller.
Introduction
Hæmatopoietiske stamceller (hscs) er selvfornyende, multi-potent, og i stand til at give anledning til alle cellerne i blodet1,2. Cellulære metabolisme er en central regulator af HSC vedligeholdelse, sammen med transkriptionelle faktorer, iboende signaler og mikromiljø3,4,5. Korrekt kontrol af mitokondrie funktion og kvalitet er derfor afgørende for HSC vedligeholdelse6,7.
Mitokondriel membran potentiale (ΔΨm) er en nøgleparameter i vurderingen af mitokondrier, da det direkte afspejler deres funktionalitet, som stammer fra balancen i protonpumpe aktivitet i elektrontransportkæden og proton strømmen gennem F 1/FO ATP syntase. Disse er begge påkrævet (afhængigt af genekspression og substrat tilgængelighed) for den iltafhængige fosforylering af ADP til ATP8,9. Ved at drage fordel af det mitokondriske rums elektron, er der udviklet forskellige potentiometriske farvestoffer til måling af ΔΨm. En af dem er tetramethylrhodamin methylester perchlorat (TMRM), som er blevet flittigt anvendt til at måle ΔΨm ved flow cytometri i en række celler10, herunder hæmatopoietisk stilk og stamceller11.
Mitokondrie farvestoffer skal anvendes med en vis forsigtighed i hscs, men fordi den høje aktivitet af xenobiotiske effluks pumper af disse celler kan resultere i Dye ekstrudering12. Faktisk har ekstrudering af mitokondrie farvestoffer som Rhodamine 123 gjort det muligt for forskerne at isolere HSCs13 eller identificere HSC “side populationer” ved at udnytte differentialekstrudering af farvestofferne Hoechst Blue og Hoechst Red14, 15. det er også blevet påvist, at Fumitremorgin C, der er en specifik blokker af ATP-bindings kassetten under familie G member 2 (ABCG2), ikke påvirker farvnings mønsteret for MitoTracker i HSPCs16. Efter offentliggørelsen af disse resultater blev der udført flere undersøgelser ved hjælp af mitokondrie farvestoffer i fravær af xenobiotiske effluks-pumpe hæmmere, hvilket førte til det udbredte indtryk, at hscs kun har et lille antal mitokondrier med lav ΔΨm16 , 17 , 18.
For nylig blev det påvist, at verapamil, en bredspektret hæmmer af effluks pumper, væsentligt ændrer farvning mønster af mitokondrie farvestof mitotracker grøn19. Denne afvigelse skyldes sandsynligvis, at Fumitremorgin C er yderst selektiv for Abcg2, mens HSCs også udtrykker andre transportører såsom Abcb1a (som kun er svagt følsom over for Fumitremorgin C)19. Vi har også rapporteret, at andre mitokondrie farvestoffer, såsom tmrm, nonyl acridin orange, og mitotracker orange (MTO) udviser de samme mønstre som mitotracker Green. Endnu vigtigere, vi har observeret, at strømnings cytometriske mønstre af Hspc’er afspejle deres ΔΨm ud over mitokondrie masse11.
Indtagelse af tmrm farvestof strengt afhænger af den negative ladning af mitokondrier, men den resulterende ophobning af farvestof er i konstant balance mellem dets indtag og clearance af effluks pumper20. Forskellen i xenobiotiske effluks pumpe udtryk mellem hscs og modne cellepopulationer påvirker denne balance og kan føre til partiske resultater. Brugen af dedikerede hæmmere såsom verapamil bør overvejes i analysen af ΔΨm af potentiometriske farvestoffer. Her beskriver vi en modificeret protokol for nøjagtig ΔΨm måling af tmrm-baseret flow cytometri, som korrigerer for xenobiotiske transporter aktivitet gennem brug af dedikerede hæmmere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondriel membran potentiel måling er en hjørnesten i analysen og vurderingen af mitokondrier, som er afgørende for den metaboliske tilstand af cellen. Her beskriver vi en protokol til analyse af ΔΨm ved TMRM-farvning. TMRM er en celle-permente fluorescerende farvestof, der ophobes i aktive mitokondrier på grund af ΔΨm, og dens respektive niveauer forbliver i ligevægt mellem de ekstracellulære, cytoplasmiske og mitokondrie rum10. Denne protokol kan tilpasses til forskellige farvestoff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker alle medlemmer af Ito laboratorium, især K Ito og H Sato, og Einstein stamcelle Institute for kommentarer og Einstein flow cytometry og analytiske Imaging Core faciliteter (finansieret af National Cancer Institute Grant P30 CA013330) for hjælpe med at udføre forsøgene. K.I. er støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 og R01DK100689) og New York State Department of Health som Core Director of Einstein enkelt celle Genomics/epigenomics (C029154). K.I. Ito er en forsker i leukæmi og lymfomer samfund.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
