Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen
Summary
Xenobiotic Efflux pompen zijn zeer actief in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc’s) en veroorzaken extrusie van TMRM, een mitochondriale membraan potentiële fluorescerende kleurstof. Hier presenteren we een protocol om het mitochondriale membraan potentieel in Hspc’s met TMRM nauwkeurig te meten in aanwezigheid van verapamil, een effluxpomp remmer.
Abstract
Als cellulaire metabolisme is een belangrijke regulator van hematopoietische stamcel (HSC) zelf vernieuwing, de verschillende rollen gespeeld door de mitochondriën in hematopoietische homeostase zijn uitgebreid bestudeerd door HSC onderzoekers. Mitochondriale activiteit niveaus worden weerspiegeld in hun membraan mogelijkheden (ΔΨm), die kan worden gemeten door cel-perbetekende kationische kleurstoffen zoals tmrm (tetramethylrhodamine, methyl ester). Het vermogen van effluxpompen om deze kleurstoffen uit cellen te extrumaken, kan echter hun bruikbaarheid beperken. De resulterende meet bias is met name van cruciaal belang bij de beoordeling van HSCs, omdat xenobiotische transporters hogere niveaus van expressie en activiteit vertonen in HSCs dan in gedifferentieerde cellen. Hier beschrijven we een protocol met behulp van verapamil, een effluxpomp remmer, om nauwkeurig ΔΨm te meten over meerdere beenmerg populaties. De resulterende remming van de activiteit van de pomp is aangetoond dat de intensiteit van de TMRM in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc’s) te verhogen, terwijl het verlaten van het relatief onveranderd in rijpe fracties. Dit benadrukt de nauwe aandacht voor kleurstof-Efflux activiteit die nodig is wanneer ΔΨm-afhankelijke kleurstoffen worden gebruikt, en zoals geschreven en gevisualiseerd, dit protocol kan worden gebruikt om nauwkeurig te vergelijken ofwel verschillende populaties binnen het beenmerg, of dezelfde populatie over verschillende experimentele modellen.
Introduction
Hematopoietische stamcellen (hscs) zijn zelfvernieuwend, multi-potent, en kunnen aanleiding geven tot alle cellen van het bloed1,2. Cellulaire metabolisme is een belangrijke regulator van HSC-onderhoud, samen met transcriptionele factoren, intrinsieke signalen en de micro-omgeving3,4,5. De juiste controle van de mitochondriale functie en kwaliteit is daarom van cruciaal belang voor HSC-onderhoud6,7.
Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) is een belangrijke parameter in de beoordeling van mitochondriën als het direct weerspiegelt hun functionaliteit, die voortvloeit uit het evenwicht van proton pomp activiteit in de elektronentransport keten en de Proton stroom door F 1/FO ATP-synthase. Deze zijn beide nodig (afhankelijk van de genexpressie en beschikbaarheid van het substraat) voor de zuurstof afhankelijke fosforylering van ADP naar ATP8,9. Door gebruik te maken van de electronegativiteit van het mitochondriale compartiment zijn verschillende potentiometrische kleurstoffen ontwikkeld om ΔΨm te meten. Een van hen is tetramethylrhodamine methyl ester perchloraat (TMRM), die uitgebreid is gebruikt voor het meten van ΔΨm doorstroming cytometrie in een verscheidenheid van cellen10, met inbegrip van hematopoietische stam en voorlopercellen11.
Mitochondriale kleurstoffen moeten worden gebruikt met enige voorzichtigheid in HSCs, echter, omdat de hoge activiteit van de xenobiotische Efflux pompen van deze cellen kan resulteren in kleurstof extrusie12. Inderdaad, de extrusie van mitochondriale kleurstoffen zoals Rhodamine 123 heeft onderzoekers toegestaan HSCs13 te isoleren of te identificeren HSC “side populaties” door het benutten van de differentiële extrusie van de kleurstoffen Hoechst blauw en Hoechst rood14, 15. ook is aangetoond dat Fumitremorgin C, een specifieke blokkade van de ATP-bindende cassette subgroep G member 2 (ABCG2), geen invloed heeft op het kleurings patroon van MitoTracker in HSPCs16. Na de publicatie van deze resultaten, meerdere studies werden uitgevoerd met behulp van mitochondriale kleurstoffen in de afwezigheid van xenobiotische Efflux pomp remmers, wat leidt tot de wijdverbreide indruk dat HSCs slechts een klein aantal mitochondriën met lage ΔΨm hebben16 , 17 , 18.
Onlangs werd echter aangetoond dat verapamil, een breed spectrum remmer van effluxpompen, het kleurings patroon van de mitochondriale kleurstof MitoTracker Green19aanzienlijk wijzigt. Dit verschil is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat Fumitremorgin C zeer selectief is voor Abcg2, terwijl HSCs ook andere transporters uitdrukken, zoals Abcb1a (die slechts zwak gevoelig is voor Fumitremorgin C)19. We hebben ook gemeld dat andere mitochondriale kleurstoffen, zoals TMRM, nonyl acridine Orange en Mitotracker Orange (MTO) dezelfde patronen vertonen als Mitotracker Green. Wat nog belangrijker is, we hebben geconstateerd dat de Flow cytometrische patronen van HSPCs weerspiegelen hun ΔΨm in aanvulling op mitochondriale massa11.
De inname van TMRM kleurstof is strikt afhankelijk van de negatieve lading van de mitochondriën, maar de resulterende accumulatie van kleurstof is in constante balans tussen de inname en de klaring door Efflux pompen20. Het verschil in xenobiotische effluxpomp expressie tussen HSCs en volwassen celpopulaties beïnvloedt dit evenwicht en kan leiden tot bevooroordeelde resultaten. Het gebruik van speciale remmers zoals verapamil moet worden overwogen bij de analyse van ΔΨm door potentiometrische kleurstoffen. Hier beschrijven we een gewijzigd protocol voor nauwkeurige ΔΨm meting door TMRM gebaseerde flow cytometrie die corrigeert voor xenobiotische Transporter activiteit door het gebruik van speciale remmers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitochondriale membraan potentiële meting is een hoeksteen van de analyse en de beoordeling van de mitochondriën, die essentieel zijn voor de metabole toestand van de cel. Hier beschrijven we een protocol voor de analyse van ΔΨm door TMRM-kleuring. TMRM is een cel-perbetekende fluorescerende kleurstof die accuiteert in actieve mitochondriën als gevolg van ΔΨm, en de respectieve niveaus blijven in evenwicht tussen de extracellulaire, cytoplasmische en mitochondriale compartimenten10. Dit pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken alle leden van het ITO laboratorium, in het bijzonder K Ito en H Sato, en het Einstein stamcel instituut voor commentaren en de Einstein flow Cytometry en analytische Imaging Core facilities (gefinancierd door National Cancer Institute Grant P30 CA013330) voor helpen bij het uitvoeren van de experimenten. K.I. wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 en R01DK100689) en het New York State Department of Health als kern directeur van Einstein single-cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. ito is een onderzoeker van de leukemie en de lymfoom Society.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
