Xenobiotische Efflux-Pumpen sind hochaktiv in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und verursachen die Extrusion von TMRM, einem mitochondrialen Membranpotenzial fluoreszierender Farbstoff. Hier stellen wir ein Protokoll zur genauen Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in HSPCs durch TMRM in Gegenwart von Verapamil, einem Efflux-Pumpeninhibitor, vor.
Da der Zellstoffwechsel ein wichtiger Regulator der hämatopoetischen Stammzell-Selbsterneuerung (HSC) ist, wurden die verschiedenen Rollen, die die Mitochondrien bei der hämatopoetischen Homöostase spielen, von HSC-Forschern ausgiebig untersucht. Die mitochondrialen Aktivitätsniveaus spiegeln sich in ihren Membranpotentialen wider, die durch zellpermeant kationische Farbstoffe wie TMRM (Tetramethylrhodamin, Methylester) gemessen werden können. Die Fähigkeit von Effluxpumpen, diese Farbstoffe aus Zellen zu extrudieren, kann jedoch ihre Nützlichkeit einschränken. Die resultierende Messverzerrung ist besonders kritisch bei der Beurteilung von HSCs, da xenobiotische Transporter in HSCs eine höhere Expression und Aktivität aufweisen als in differenzierten Zellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Verapamil, einen Efflux-Pumpeninhibitor, verwendet, um mehrere Knochenmarkpopulationen genau zu messen. Die daraus resultierende Hemmung der Pumpenaktivität erhöht nachweislich die TMRM-Intensität in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), während sie in reifen Fraktionen relativ unverändert bleibt. Dies unterstreicht die Aufmerksamkeit auf die Farb-Efflux-Aktivität, die erforderlich ist, wenn m-abhängige Farbstoffe verwendet werden, und wie geschrieben und visualisiert, kann dieses Protokoll verwendet werden, um entweder verschiedene Populationen innerhalb des Knochenmarks oder die gleiche Population genau zu vergleichen. über verschiedene experimentelle Modelle hinweg.
Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind sich selbst erneuernd, multipotent und in der Lage, alle Zellen des Blutes1,2zu entsteht. Der Zellstoffwechsel ist ein wichtiger Regulator der HSC-Wartung, zusammen mit Transkriptionsfaktoren, intrinsischen Signalen und der Mikroumgebung3,4,5. Die richtige Kontrolle der mitochondrialen Funktion und Qualität ist daher entscheidend für die HSC-Wartung6,7.
Mitochondriales Membranpotential ist ein wichtiger Parameter bei der Beurteilung von Mitochondrien, da sie direkt ihre Funktionalität widerspiegelt, die sich aus dem Gleichgewicht der Protonenpumpaktivität in der Elektronentransportkette und des Protonenflusses durch F ergibt. 1/FO ATP-Synthase. Diese sind beide (abhängig von der Genexpression und substratverfügbarkeit) für die sauerstoffabhängige Phosphorylierung von ADP zu ATP8,9erforderlich. Unter Ausnutzung der Elektronegativität des mitochondrialen Fachs wurden verschiedene potentiometrische Farbstoffe entwickelt, um die Messung von m zu messen. Eines davon ist Tetramethylrhodinmethylesterperchlorat (TMRM), das ausgiebig verwendet wurde, um die Durchflusszytometrie in einer Vielzahl von Zellen10zu messen, einschließlich hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen11.
Mitochondriale Farbstoffe müssen jedoch mit einer gewissen Vorsicht in HSCs verwendet werden, da die hohe Aktivität der xenobiotischen Efflux-Pumpen dieser Zellen zu Farbstoffextrusion führen kann12. Tatsächlich hat die Extrusion von mitochondrialen Farbstoffen wie Rhodamine 123 es Forschern ermöglicht, HSCs13 zu isolieren oder HSC-“Seitenpopulationen” zu identifizieren, indem sie die Differentialextrusion der Farbstoffe Hoechst Blue und Hoechst Red14 ausnutzen. 15. Es hat sich auch gezeigt, dass Fumitremorgin C, ein spezifischer Blocker des ATP-bindenden Kassetten-Unterfamilien-Unterfamilien-G-Mitglieds-2 (ABCG2)-Transporters, das Färbemuster von MitoTracker in HSPCs16nicht beeinflusst. Nach der Veröffentlichung dieser Ergebnisse wurden mehrere Studien mit mitochondrialen Farbstoffen in Abwesenheit von xenobiotischen Efflux-Pumpeninhibitoren durchgeführt, was zu dem weit verbreiteten Eindruck führte, dass HSCs nur eine geringe Anzahl von Mitochondrien mit niedrigem , 17 , 18.
Kürzlich wurde jedoch nachgewiesen, dass Verapamil, ein Breitspektrum-Inhibitor von Efflux-Pumpen, das Färbemuster des mitochondrialen Farbstoffs MitoTracker Green19signifikant verändert. Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass Fumitremorgin C sehr selektiv für Abcg2 ist, während HSCs auch andere Transporter wie Abcb1a (das nur schwach empfindlich auf Fumitremorgin C)19ausdrückt. Wir haben auch berichtet, dass andere mitochondriale Farbstoffe, wie TMRM, Nonyl-Akridin-Orange und Mitotracker Orange (MTO) die gleichen Muster wie Mitotracker Green aufweisen. Noch wichtiger ist, dass wir beobachtet haben, dass die zytometrischen Strömungsmuster von HSPCs zusätzlich zu der mitochondrialen Masse11ihre M widerspiegeln.
Die Aufnahme von TMRM-Farbstoff hängt streng von der negativen Ladung von Mitochondrien ab, aber die resultierende Ansammlung von Farbstoff ist in einem konstanten Gleichgewicht zwischen seiner Aufnahme und Clearance durch Effluxpumpen20. Der Unterschied in der xenobiotischen Efflux-Pumpenexpression zwischen HSCs und reifen Zellpopulationen wirkt sich auf dieses Gleichgewicht aus und kann zu verzerrten Ergebnissen führen. Die Verwendung von speziellen Inhibitoren wie Verapamil sollte bei der Analyse von ‘m durch potentiometrische Farbstoffe berücksichtigt werden. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zur genauen Messung durch TMRM-basierte Durchflusszytometrie, das die xenobiotische Transportaktivität durch den Einsatz spezieller Inhibitoren korrigiert.
Die mitochondriale Membranpotentialmessung ist ein Eckpfeiler der Analyse und Bewertung von Mitochondrien, die für den Stoffwechselzustand der Zelle entscheidend sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse von M durch TMRM-Färbung. TMRM ist ein zellpermeant Fluoreszenzfarbstoff, der sich in aktiven Mitochondrien aufgrund von m ansammelt, und seine jeweiligen Werte bleiben im Gleichgewicht zwischen den extrazellulären, zytoplasmatischen und mitochondrialen Kompartimenten10. Dieses Proto…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken allen Mitgliedern des Ito-Labors, insbesondere K Ito und H Sato, und dem Einstein Stem Cell Institute für Kommentare und den Kerneinrichtungen Einstein Flow Cytometry and Analytical Imaging (gefördert vom National Cancer Institute Grant P30 CA013330) für Hilfe bei der Durchführung der Experimente. K.I. wird von den National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 und R01DK100689) und dem New York State Department of Health als Core Director of Einstein Single-Cell Genomics/Epigenomics (C029154) unterstützt. K.I. Ito ist Forschungsstipendiat der Leukämie- und Lymphom-Gesellschaft.
ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |