שיפור הדיוק של הערכה להערכת הזרימה של הפוטנציאל לממברנה מיטוכונדריאלי בתאי המטפאות ובתאים באמצעות עיכוב של משאבות אפלוקס
Summary
משאבות xenoביוטיקה פעילים מאוד בתאי גזע ומחולל קדמון (HSPCs) ולגרום שחול TMRM, קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאל לצבוע פלורסנט. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במדויק פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי ב HSPCs על ידי TMRM בנוכחות Verapamil, מדכא משאבת משאבה.
Abstract
כמו חילוף החומרים הסלולר הוא וסת המפתח של תא גזע המטבית (HSC) התחדשות עצמית, התפקידים השונים שיחק על ידי המיטואיטין הומאוסטזיס ההטיות כבר נחקרו בהרחבה על ידי חוקרים HSC. רמות פעילות מיטוכונדריאלי משתקפות בפוטנציאל הממברנה שלהם (ΔΨm), שניתן למדוד אותם על-ידי שלבים העלולים להיות מיועדים לצבעים כגון TMRM (טטרמתיל, מתיל אסתר). היכולת של משאבות אפלוקס להבלטת צבעים אלה מתאים יכולים להגביל את התועלת שלהם, עם זאת. הטיית המדידה המתקבלת היא קריטית במיוחד בעת הערכת HSCs, כשטרנספורטי מובילים מציגים רמות גבוהות יותר של ביטוי ופעילות ב-HSCs מאשר בתאים המובחנים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ניצול Verapamil, מעכב משאבת משאבה, כדי למדוד במדויק ΔΨm על פני אוכלוסיות מרובות מח עצם. העיכוב כתוצאה של פעילות המשאבה מוצג כדי להגביר את עוצמת TMRM בתוך המטפאות גזע ומחולל קדמון (HSPCs), תוך השארת אותו ללא שינוי יחסית בשברים בוגרים. פעולה זו מדגישה את תשומת הלב הקרובה לפעילות צבען-אפלוקס הדרושה כאשר משתמשים בצבעים תלויי-ΔΨm, וכמו שכתוב ודמיינו, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות בין אוכלוסיות שונות בתוך מח העצם, או באותה אוכלוסייה על-פני דגמים ניסיוניים שונים.
Introduction
תאי גזע המטפאות (HSCs) מחדשים את עצמם, רב-עוצמה, ומסוגלים להצמיח את כל תאי הדם1,2. מטבוליזם הסלולר הוא וסת מפתח של תחזוקה hsc, יחד עם גורמים transcript, אותות פנימיים ומיקרואקולוגיה3,4,5. השליטה הנכונה של תפקוד מיטוכונדריאלי ואיכות הוא אפוא קריטי לתחזוקת hsc6,7.
פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) הוא פרמטר מפתח להערכת המיטו, כפי שהוא משקף ישירות את הפונקציונליות שלהם, אשר נובעת משיווי משקל של פעילות שאיבה פרוטון בשרשרת התחבורה אלקטרון וזרימת פרוטון דרך F 1/FO ATP סטנדרטים. אלה הן נדרשות (בהתאם לביטוי הגנים וזמינות המצע) עבור זירחון תלוי-החמצן של ADP ל-ATP8,9. לנצל את אלקטרושליליות של תא מיטוכונדריאלי, צבעים שונים בפוטנציאל פותחו כדי למדוד ΔΨm. אחד מהם הוא טטרמתיל מתיל (TMRM), אשר שימש בהרחבה כדי למדוד ΔΨm על ידי זרימה cy, לנסות במגוון של תאים10, כולל גזע המטפאות ובתאי מחולל11.
צבעים מיטוכונדריאלי חייב להיות בשימוש עם כמה זהירות ב HSCs, עם זאת, מכיוון הפעילות הגבוהה של משאבות xenobiotic יוטי של תאים אלה יכול לגרום לצבוע שחול12. אכן, שחול של צבעים מיטוכונדריאלי כגון Rhodamine 123 התיר לחוקרים לבודד HSCs13 או לזהות hsc “אוכלוסיות צד” על ידי ניצול ההבלטה הדיפרנציאלי של הצבעים כחול הכחול האדום14, 15. כמו כן הוכח כי הג ג’ין, חוסם מסוים של ה-ATP-משפחה של הקלטת משנה G-חבר 2 (ABCG2) טרנספורטר, אינו משפיע על דפוס הצביעת של MitoTracker ב HSPCs16. לאחר פרסום של תוצאות אלה, מחקרים מרובים בוצעו באמצעות צבעים מיטוכונדריאלי בהעדר מעכבי משאבת xenobiotic יוטי, המוביל הרושם הנרחב כי HSCs יש רק מספר קטן של המיטולוגיה עם נמוך ΔΨm16 , מיכל בן 17 , . שמונה עשרה
לאחרונה, זה הוכח, עם זאת, כי Verapamil, מעכב ספקטרום רחב של משאבות אפלוקס, משנה באופן משמעותי את דפוס הצביעת של מיטוכונדריאל מימעקב ירוק19. פער זה סביר בגלל העובדה כי FumitAbcg2 ג ‘ ין הוא סלקטיבי מאוד עבור, בעוד HSCs גם לבטא מובילים אחרים כגון Abcb1a (אשר רק רגיש חלש כדי Fumit, ג’ין ג)19. אנו דיווחו גם כי צבעים מיטוכונדריאלי אחרים, כגון TMRM, Nonyl כתומה כתום, ו Mitotracker אורנג ‘ (MTO) התערוכה דפוסים כמו מיטומו גרין. חשוב מכך, הבחנו בכך שדפוסי הזרימה של HSPCs משקפים את ΔΨm בנוסף למסה מיטוכונדריאלי11.
צריכת הצבע TMRM תלוי בקפדנות על המטען השלילי של המיטומטר, אבל הצטברות של צבע כתוצאה מכך הוא באיזון תמידי בין צריכת והסיווג שלה על ידי משאבות אפלוקס20. ההבדל בביטוי xenobiotic יוטי משאבת בין HSCs ואוכלוסיות תאים בוגרים משפיע על איזון זה יכול להוביל לתוצאות מוטה. השימוש של מעכבי ייעודי כגון Verapamil צריך להיחשב ניתוח של ΔΨm על ידי צבעים בעלי פוטנציאל ממטרי. כאן אנו מתארים פרוטוקול שונה עבור מדידה ΔΨm מדויקת על ידי מבוססי TMRM הזרימה cy try אשר מתקן עבור פעילות השיגור xenobiotic יוטי באמצעות מעכבי ייעודי.
Protocol
Representative Results
Discussion
המדידה הפוטנציאלית של קרום מיטוכונדריאלי היא אבן פינה של ניתוח והערכה של המיטו, אשר הם קריטיים למצב המטבולית של התא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח של ΔΨm על ידי כתמים TMRM. TMRM הוא צבע הניאון האמור לצבוע אשר מצטבר פעיל המיטומטר בשל ΔΨm, ואת הרמות המתאימות שלה להישאר בשיווי משקל בין מסחטות, cytopl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לכל חברי המעבדה איטו, במיוחד K Ito ו-H סאטו, ו איינשטיין תא גזע המכון להערות הארגון איינשטיין Cy, הדמיה אנליטית מתקנים ליבה (ממומן על ידי המכון הלאומי לסרטן גרנט P30 CA013330) עבור סייע בביצוע הניסויים. K.I. נתמך על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (R01DK98263, R01DK115577, ו R01DK100689) ואת משרד ניו יורק המדינה לבריאות כמו מנהל ליבה של איינשטיין תא בודד גנומיקה/אפיגנומיקה (C029154). K.I. Ito הוא מלומד מחקר של החברה לוקמיה ולימפומה.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
