流出ポンプの阻害による造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の流れ細胞測定評価の精度向上
Summary
ゼノバイオティック流出ポンプは造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)において非常に活性であり、ミトコンドリア膜電位蛍光色素であるTMRMの押し出しを引き起こす。ここでは、流出ポンプ阻害剤であるベラパミルの存在下でTMRMによるHSPCにおけるミトコンドリア膜電位を正確に測定するプロトコルを提示する。
Abstract
細胞代謝は造血幹細胞(HSC)自己再生の重要な調節剤であるため、造血恒常性恒常性におけるミトコンドリアが果たした様々な役割は、HSCの研究者によって広範囲に研究されている。ミトコンドリア活性レベルは、膜電位(Δμm)に反映され、TMRM(テトラメチルロダミン、メチルエステル)などの細胞透過性カチオン染料によって測定することができる。しかし、これらの染料を細胞から押し出す流出ポンプの能力は、その有用性を制限することができます。結果として得られる測定バイアスは、XCを評価する際に特に重要であり、異種生物輸送体は分化細胞よりもHSCにおいて高いレベルの発現および活性を示す。ここでは、流出ポンプ阻害剤であるベラパミルを利用して、複数の骨髄集団にわたってΔを正確に測定するプロトコルについて述べる。ポンプ活性の結果生じる阻害は、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるTMRM強度を増加させ、成熟分画では比較的変化しないままにすることが示されている。これは、Δm依存染料を使用する際に必要な色素流出活性に細心の注意を払っており、書き込みと視覚化に従って、このプロトコルを使用して、骨髄内の異なる集団または同じ集団を正確に比較するために使用できます。異なる実験モデル間で。
Introduction
造血幹細胞(HSC)は、自己更新、多能性、および血液1、2のすべての細胞を生み出すことができる。細胞代謝は、転写因子、固有シグナルおよび微小環境3、4、5と共に、HSC維持の主要な調節因子である。したがって、ミトコンドリアの機能と品質の適切な制御は、HSCメンテナンス6、7に不可欠です。
ミトコンドリア膜電位(Δ)は、ミトコンドリアの機能性を直接反映するミトコンドリアの評価において重要なパラメータであり、電子輸送鎖におけるプロトンポンプ活性の平衡とFを通るプロトン流量に由来する。1/FO ATP シンタゼス。これらはいずれも、ATP8,9に対するADPの酸素依存性リン酸化に対して(遺伝子発現および基質の利用可能性に応じて)必要である。ミトコンドリアコンパートメントの電子化を利用して、Δを測定するために様々なポテンショメトリック染料が開発されました。そのうちの一つは、テトラメチルロダミン過塩素酸メチルエステル(TMRM)であり、造血幹細胞および前駆細胞11を含む様々な細胞10におけるフローサイトメトリーによるΔμmの測定に広く用いられている。
ミトコンドリア染料は、しかし、これらの細胞の異種生体流出ポンプの高い活性が色素押出12をもたらす可能性があるため、HSCでいくつかの注意を払って使用する必要があります。実際、ローダミン123のようなミトコンドリア染料の押し出しは、研究者がHSC13を分離したり、染料のホエシュトブルーとホーチストレッド14の差動押出を利用してHSCの「側集団」を同定することを可能にしました。15.ATP結合カセットサブファミリーG部材2(ABCG2)トランスポーターの特定ブミグレジンCは、HSPC16におけるMitoTrackerの染色パターンに影響を与えないことも示されている。これらの結果の公表後、異種生物性流出ポンプ阻害剤が存在しない場合にミトコンドリア染料を用いて複数の研究を行い、HSCは低Δμm16のミトコンドリアの数が少ないという印象を広めました。,17歳,18.
しかし最近、流出ポンプの広いスペクトル阻害剤であるベラパミルが、ミトコンドリア染料MitoTracker Green19の染色パターンを有意に改変することが実証された。この不一致は、フミモルジンCがAbcg2に対して非常に選択的であるという事実に起因する可能性が高く、HSCはまた、Abcb1a(フミモルジンCに弱く敏感である)19などの他のトランスポーターを発現する。また、TMRM、ノニルアクリジンオレンジ、ミトトラッカーオレンジ(MTO)などの他のミトコンドリア染料は、ミトトラッカーグリーンと同じパターンを示しています。さらに重要なことは、HSPCの流れサイトメトリックパターンがミトコンドリア質量11に加えてΔを反映していることを観察した。
TMRM色素の摂取量は、ミトコンドリアの負電荷に厳密に依存するが、結果として生じる色素の蓄積は、流出ポンプ20によるその摂取量とクリアランスとの間で一定のバランスにある。HSCと成熟細胞集団との間の異性生物性流出ポンプ発現の違いは、このバランスに影響を与え、偏った結果につながる可能性があります。ベラパミルなどの専用阻害剤の使用は、強力な染料によるΔmの分析において考慮されるべきである。ここでは、専用阻害剤を用いて異種生物生トランスポーター活性を補正するTMRMベースのフローサイトメトリーによる正確なΔm測定のための改変プロトコルについて説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミトコンドリア膜電位測定は、細胞の代謝状態に重要なミトコンドリアの分析と評価の基礎である。ここでは、TMRM染色によるΔの分析のためのプロトコルについて説明する。TMRMは、Δに起因する活性ミトコンドリアに蓄積する細胞透過性蛍光色素であり、そのそれぞれのレベルは、細胞外、細胞質およびミトコンドリア区画10の間の平衡状態のままである。このプロトコル?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、伊藤研究室、特に伊藤健・佐藤H、アインシュタイン幹細胞研究所のコメントとアインシュタイン流動細胞法および分析イメージングコア施設(国立がん研究所助成金P30 CA013330)の全メンバーに感謝します。実験を行うのを助ける。K.I.は、国立衛生研究所(R01DK98263、R01DK115577、R01DK100689)およびアインシュタイン単一細胞ゲノミクス/エピゲノミクス(C029154)のコアディレクターとしてニューヨーク州保健省からの助成金によってサポートされています。伊藤さんは白血病・リンパ腫学会の研究員です。
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
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