Forbedre nøyaktigheten av Flow analytiske vurdering av mitokondrie membran potensialet i blodkreft stem og stamceller gjennom hemming av utstrømming pumper
Summary
Xenobiotic oval utstrømming pumper er svært aktive i blodkreft stem og stamceller (HSPCs) og forårsake ekstrudering av TMRM, en mitokondrie membran potensial fluorescerende fargestoff. Her presenterer vi en protokoll for å nøyaktig måle mitokondrie membran potensial i HSPCs av TMRM i nærvær av Verapamil, en utstrømming pumpe inhibitor.
Abstract
Som cellulær metabolisme er en nøkkel regulator av blodkreft stilk cellen (HSC) selv-fornyelse, de ulike rollene spilt av mitokondrier i blodkreft homeostase har blitt grundig studert ved HSC forskere. Mitokondrie aktivitet nivåer gjenspeiles i deres membran potensialer (ΔΨm), som kan måles ved celle-permeant kationiske fargestoffer som TMRM (tetramethylrhodamine, metyl Ester). Muligheten for utstrømming pumper å extrude disse fargestoffer fra celler kan begrense nytten, men. Den resulterende målingen bias er spesielt kritisk når vurdere HSCs, som xenobiotic oval transportører viser høyere nivåer av uttrykk og aktivitet i HSCs enn i differensiert celler. Her beskriver vi en protokoll som bruker Verapamil, en utstrømming pumpe inhibitor, for å nøyaktig måle ΔΨm på tvers av flere benmarg populasjoner. Den resulterende hemming av pumpen aktivitet er vist å øke TMRM intensitet i blodkreft stilk og stamceller (HSPCs), mens du forlater det relativt uendret i modne fraksjoner. Dette fremhever den nære oppmerksomheten til Dye-utstrømming aktivitet som er nødvendig når ΔΨm-avhengige fargestoffer brukes, og som skrevet og visualisere, denne protokollen kan brukes til å nøyaktig sammenligne enten ulike populasjoner i benmargen, eller samme befolkning på tvers av ulike eksperimentelle modeller.
Introduction
Blodkreft stamceller (HSCs) er selv fornye, multi-potente, og i stand til å gi opphav til alle cellene i blodet1,2. Cellular metabolisme er en nøkkel regulator av HSC vedlikehold, sammen med transcriptional faktorer, indre signaler og mikromiljøet3,4,5. Riktig kontroll av mitokondrie funksjon og kvalitet er derfor avgjørende for HSC vedlikehold6,7.
Mitokondrie membran potensial (ΔΨm) er en viktig parameter i vurderingen av mitokondrier som det direkte reflekterer deres funksjonalitet, som stammer fra likevekt av Proton pumping aktivitet i elektron transport kjeden og Proton strømme gjennom F 1/FO ATP-syntase. Dette er både nødvendig (avhengig av genuttrykk og substrat tilgjengelighet) for oksygen avhengige fosforylering av ADP til ATP8,9. Dra nytte av elektronegativitet av mitokondrie kupé, har ulike potensiometrisk fargestoffer er utviklet for å måle ΔΨm. En av dem er tetramethylrhodamine metyl Ester perklorat (TMRM), som har vært mye brukt til å måle ΔΨm ved flyt flowcytometri i en rekke celler10, inkludert blodkreft stammen og stamceller11.
Mitokondrie fargestoffer må brukes med en viss forsiktighet i HSCs, men fordi den høye aktiviteten av xenobiotic oval utstrømming pumper av disse cellene kan resultere i fargestoff ekstrudering12. Faktisk er ekstrudering av mitokondrie fargestoffer som Rhodamine 123 tillot forskerne å isolere HSCs13 eller identifisere HSC “side populasjoner” ved å utnytte differensial ekstrudering av fargestoffer Hoechst blå og Hoechst rød14, 15. det har også blitt vist at Fumitremorgin C, en bestemt blokkering av den ATP-binding kassett sub-familien G medlem 2 (ABCG2) transportør, ikke påvirker farging mønster av MitoTracker i HSPCs16. Etter utgivelsen av disse resultatene, ble flere studier utført ved hjelp av mitokondrie fargestoffer i fravær av xenobiotic oval utstrømming pumpe hemmere, fører til utbredt inntrykk av at HSCs har bare et lite antall mitokondrier med lav ΔΨm16 , 17 i , 18 i år.
Nylig ble det demonstrert, men at Verapamil, et bredt spekter inhibitor av utstrømming pumper, endrer farge mønster av mitokondrie fargestoff MitoTracker Green19. Dette avviket skyldes sannsynligvis det faktum at Fumitremorgin C er svært selektiv for Abcg2, mens HSCs også uttrykker andre transportører som Abcb1a (som bare er svakt følsomme for Fumitremorgin C)19. Vi har også rapportert at andre mitokondrie fargestoffer, som TMRM, Nonyl Akridin oransje, og Mitotracker Orange (MTO) viser de samme mønstrene som Mitotracker Green. Enda viktigere, vi har observert at flyten analytiske mønstre av HSPCs reflekterer deres ΔΨm i tillegg til mitokondrie masse11.
Inntak av TMRM fargestoff avhenger strengt på den negative belastningen av mitokondrier, men den resulterende akkumulering av fargestoff er i konstant balanse mellom inntak og klaring ved utstrømming pumper20. Forskjellen i xenobiotic oval utstrømming pumpe uttrykk mellom HSCs og modne celle populasjoner påvirker denne balansen, og kan føre til partisk resultater. Bruk av dedikerte hemmere som Verapamil bør vurderes i analysen av ΔΨm av potensiometrisk fargestoffer. Her beskriver vi en modifisert protokoll for nøyaktig ΔΨm-måling ved TMRM-baserte strømnings flowcytometri som korrigerer for xenobiotic oval transporter aktivitet gjennom bruk av dedikerte hemmere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrie membran potensielle målingen er en hjørnestein i analyse og vurdering av mitokondrier, som er avgjørende for metabolsk tilstand av cellen. Her beskriver vi en protokoll for analyse av ΔΨm ved TMRM farging. TMRM er et celle-permeant fluorescerende fargestoff som akkumuleres i aktiv mitokondrier på grunn av ΔΨm, og de respektive nivåene forblir i likevekt mellom ekstracellulære, cytoplasmatiske og mitokondrie rom10. Denne protokollen kan tilpasses for ulike fargestoffer, inklud…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker alle medlemmer av Ito laboratorium, spesielt K Ito og H Sato, og Einstein Stem Cell Institute for kommentarer og Einstein Flow flowcytometri og Analytical Imaging kjerne anlegg (finansiert av National Cancer Institute Grant P30 CA013330) for hjelp til å utføre eksperimentene. K.I. støttes av tilskudd fra National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577, og R01DK100689) og New York State Department of Health som Core Director of Einstein single-Cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. Ito er en forsknings forsker av leukemi og lymfom Society.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
