Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux
Summary
As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.
Abstract
Como o metabolismo celular é um regulador chave da autorenovação de células-tronco hematopoiéticas (HSC), os vários papéis desempenharam as mitocôndria na homeostase hematopoiética têm sido extensivamente estudados por pesquisadores do HSC. Os níveis de atividade mitocondrial são refletidos em seus potenciais de membrana (Δm), que podem ser medidos por corantes catiônicos celulares, como TMRM (tetrametilrodamina, éster metílico). A capacidade de bombas de efluxo para expulsar esses corantes de células pode limitar a sua utilidade, no entanto. O viés de mensuração resultante é particularmente crítico na avaliação de HSCs, uma vez que os transportadores xenobióticos exibem níveis mais elevados de expressão e atividade em HSCs do que em células diferenciadas. Aqui, nós descrevemos um protocolo que utiliza o verapamil, um inibidor da bomba de efluxo, para medir exatamente o Δ, em várias populações de medula óssea. A inibição resultante da atividade da bomba é mostrada para aumentar a intensidade de TMRM em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor (HSPCs), ao deixá-la relativamente inalterada em frações maduras. Isto destaca a atenção estreita à atividade do tingimento-efflux que é exigida quando os corantes Δm-dependentes são usados, e como escrito e visualizado, este protocolo pode ser usado para comparar com precisão as populações diferentes dentro da medula óssea, ou a mesma população em diferentes modelos experimentais.
Introduction
As células-tronco hematopoiéticas (hscs) são autorenováveis, multipotentes e capazes de dar origem a todas as células do sangue1,2. O metabolismo celular é um regulador chave da manutenção do HSC, juntamente com fatores transcricionais, sinais intrínsecos e o microambiente3,4,5. O controle adequado da função e qualidade mitocondrial é, portanto,crítico para a manutenção do HSC6,7.
O potencial de membrana mitocondrial (Δ, m) é um parâmetro chave na avaliação das mitocôndrias, pois reflete diretamente sua funcionalidade, que deriva do equilíbrio da atividade de bombeamento de prótons na cadeia de transporte de elétrons e o fluxo de prótons através de F 1/FO ATP Synthase. Ambos são necessários (dependendo da expressão gênica e da disponibilidade de substrato) para a fosforilação dependente do oxigênio da ADP para o ATP8,9. Aproveitando-se da eletronegatividade do compartimento mitocondrial, vários corantes potenciométricos foram desenvolvidos para medir Δm. Um deles é o perclorato de éster metílico de tetrametilrhodamina (TMRM), que tem sido amplamente utilizado para medir Δ, por citometria de fluxo em uma variedade de células10, incluindo tronco hematopoiético e células progenitoras11.
Corantes mitocondriais devem ser usados com algum cuidado em HSCs, no entanto, porque a alta atividade das bombas de efluxo xenobiótica dessas células pode resultar em extrusão de corante12. Na verdade, a extrusão de corantes mitocondriais, como a Rhodamina 123 permitiu que os pesquisadores isolem HSCs13 ou identifiquem HSC “populações laterais” explorando a extrusão diferencial dos corantes Hoechst Blue e Hoechst Red14, 15. também foi demonstrado que o Fumitremorgin C, um bloqueador específico do transportador da subfamília G do membro 2 (ABCG2) do cassette de ligação ATP, não afeta o padrão de coloração de MitoTracker em HSPCs16. Após a publicação destes resultados, vários estudos foram realizados utilizando corantes mitocondriais na ausência de inibidores da bomba de efluxo xenobióticos, levando à impressão generalizada de que os HSCs têm apenas um pequeno número de mitocôndrias com baixo Δm16 , 17 anos de , de 18 anos.
Recentemente, demonstrou-se, entretanto, que Verapamil, um inibidor largo do espectro de bombas do efluxo, modifica significativamente o teste padrão de mancha do corante mitochondrial MitoTracker verde19. Esta discrepância é provavelmente devido ao fato de que Fumitremorgin C é altamente seletivo para Abcg2, enquanto os HSCs também expressam outros transportadores, como Abcb1a (que é apenas fraca sensível a Fumitremorgin C)19. Nós igualmente relatado que outras tinturas mitochondrial, tais como tmrm, laranja do acridina do Nonyl, e laranja de MitoTracker (mto) exibem os mesmos testes padrões que o verde de MitoTracker. Mais importante, observou-se que os padrões citométricos de fluxo de HSPCs refletem seu Δm em adição à massa mitocondrial11.
A ingestão de corante TMRM depende estritamente da carga negativa das mitocôndrias, mas o acúmulo resultante de corante está em constante equilíbrio entre sua ingestão e folga por bombas de efluxo20. A diferença na expressão da bomba de efluxo xenobiótico entre HSCs e populações de células maduras afeta esse equilíbrio e pode levar a resultados tendenciosos. O uso de inibidores dedicados como o verapamil deve ser considerado na análise de Δm por corantes potenciométricos. Aqui nós descrevemos um protocolo modificado para a medida exata do δ, m pela citometria de fluxo tmrm-baseada que corrige para a atividade do transportador do xenobióticos com o uso de nervos inibidores dedicados.
Protocol
Representative Results
Discussion
A medida do potencial de membrana mitocondrial é uma pedra angular da análise e avaliação das mitocôndrias, que são críticas ao estado metabólico da célula. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a análise de Δm pela mancha de TMRM. O TMRM é um corante fluorescente que se acumula nas mitocôndrias ativas devido a Δm, e seus respectivos níveis permanecem em equilíbrio entre os compartimentos extracelular, citoplasmático e mitocondrial10. Este protocolo pode ser adaptado para vári…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a todos os membros do laboratório Ito, especialmente K Ito e H Sato, e o Einstein Stem Cell Institute para comentários e as instalações do núcleo de citometria de fluxo de Einstein e Imaging analítico (financiado pelo National Cancer Institute Grant p30 CA013330) para ajudar a realizar os experimentos. O K.I. é apoiado por doações dos institutos nacionais de saúde (R01DK98263, R01DK115577 e R01DK100689) e do departamento de saúde de Nova York como diretor principal da genômica/Epigenômica de célula única de Einstein (C029154). K.I. Ito é um estudioso de pesquisa da sociedade de leucemia e linfoma.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
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