Улучшение точности потока цитометрической оценки митохондриальной Мембраны потенциал в гематопоитических стволовых и прародителей клеток через ингибирование Efflux насосов
Summary
Насосы Xenobiotic efflux очень активны в гематопоитических стволовых и прародителей (HSPCs) и вызывают экструзию TMRM, митохондриальной мембраны потенциал флуоресцентного красителя. Здесь мы представляем протокол для точного измерения митохондриального мембранного потенциала в HSPCs TMRM в присутствии Verapamil, ингибитор насоса efflux.
Abstract
Поскольку клеточный метаболизм является ключевым регулятором самообновления гематопоитических стволовых клеток (HSC), различные роли, сыгранные митохондриями в гематопоиетическом гомеостазе, были широко изучены исследователями HSC. Уровни митохондриальной активности отражаются в их мембранных потенциалах ( им), которые могут быть измерены клеточными катионными красителями, такими как TMRM (тетраметилродамин, метил-эфир). Способность насосов efflux выдавливать эти красители из клеток может ограничить их полезность, однако. Результирующая смещение измерений особенно критично при оценке ГХК, так как ксенобиотические транспортеры обладают более высоким уровнем экспрессии и активности в ГХС, чем в дифференцированных клетках. Здесь мы описываем протокол, используя Verapamil, ингибитор насоса efflux, чтобы точно измерить м в различных популяциях костного мозга. В результате ингибирование активности насоса показано, что увеличение интенсивности TMRM в гематопоитических стволовых и прародителей клеток (HSPCs), оставляя его относительно неизменным в зрелых фракций. Это подчеркивает пристальное внимание к красителя-эффлюкс деятельности, которая требуется, когда йм-зависимых красителей используются, и, как написано и визуализированы, этот протокол может быть использован для точного сравнения либо различных популяций в костном мозге, или той же популяции различных экспериментальных моделей.
Introduction
Гематопоитические стволовые клетки (ГСК) являются самообновляющимися, мультимощными и способными дать начало всем клеткам крови1,2. Клеточный метаболизм является ключевым регулятором обслуживания HSC, наряду с транскрипционнымифакторами, интродуциальными сигналами и микросредой 3,4,5. Надлежащий контроль митохондриальной функции и качества, следовательно, имеет решающее значение для hSC обслуживания6,7.
Митохондриальный мембранный потенциал (ЗМ) является ключевым параметром в оценке митохондрий, поскольку он непосредственно отражает их функциональность, которая вытекает из равновесия протонной насосной активности в цепочке транспортировки электронов и протонного потока через F 1/FO СПФ синтаза. Они оба необходимы (в зависимости от экспрессии генов и наличия субстрата) для кислородозависимого фосфорилирования ADP до АТФ8,9. Воспользовавшись электроотрицательностью митохондриального отсека, были разработаны различные потентиометрические красители для измерения м. Одним из них является тетраметилметилродамин метил-эфирпер перхлорат (TMRM), который широко используется для измерения цитометрии потока в различных клетках10, включая гематопоитический стебель и клетки-предтечи11.
Митохондриальные красители должны быть использованы с некоторой осторожностью в HSCs, однако, потому что высокая активность ксенобиотических насосов efflux этих клеток может привести к экструзии красителя12. Действительно, экструзия митохондриальных красителей, таких как родамин 123 позволило исследователям изолировать HSCs13 или определить HSC “побочных популяций”, используя дифференциальной экструзии красителей Hoechst Blue и Hoechst Red14, 15. Было также показано, что Fumitremorgin C, конкретный блокировщик ATP-связывающей кассеты sub-family G member 2 (ABCG2) транспортер, не влияет на шаблон окрашивания MitoTracker в HSPCs16. После публикации этих результатов, несколько исследований были проведены с использованием митохондриальных красителей в отсутствие ингибиторов насоса ксенобиота, что привело к распространенному впечатлению, что HSCs имеют лишь небольшое количество митохондрий с низким , 17 Лет , 18.
Недавно было продемонстрировано, однако, что Verapamil, широкий спектр ингибитор efflux насосов, значительно изменяет окрашивающий шаблон митохондриальной краситель MitoTracker Green19. Это несоответствие, вероятно, связано с тем, что Фумитреморгин C является весьма избирательным для Abcg2, в то время как HSCs также выразить другие транспортеры, такие как Abcb1a (который только слабо чувствительны к Fumitremorgin C)19. Мы также сообщили, что другие митохондриальные красители, такие как TMRM, Nonyl acridine orange и Mitotracker Orange (MTO), демонстрируют те же модели, что и Mitotracker Green. Что еще более важно, мы заметили, что поток цитометрических моделей HSPCs отражают их йм в дополнение к митохондриальной массы11.
Потребление красителя TMRM строго зависит от отрицательного заряда митохондрий, но в результате накопления красителя находится в постоянном балансе между его потреблением и зазором на насосах efflux20. Разница в экспрессии насоса xenobiotic efflux между HSCs и возмужалыми популяциями клетки влияет на этот баланс и может вести к пристрастным результатам. Использование специальных ингибиторов, таких как Верапамил, должно быть рассмотрено при анализе «Мм» помощным красителям. Здесь мы описываем модифицированный протокол для точного измерения цитометрии потока на основе TMRM, который корректирует активность ксенобиотики переносчика с помощью специальных ингибиторов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Измерение потенциала митохондриальной мембраны является краеугольным камнем анализа и оценки митохондрий, которые имеют решающее значение для метаболического состояния клетки. Здесь мы описываем протокол для анализа ам по окрашиванию TMRM. TMRM является клеточной люминесцентной красит…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят всех членов лаборатории Ито, особенно K Ито и H Sato, и Институт стволовых клеток Эйнштейна за комментарии и Эйнштейна потока Цитометрии и аналитической визуализации основных объектов (финансируется Национальным институтом рака грант P30 CA013330) для помочь проводить эксперименты. K.I. поддерживается грантами Национальных институтов здравоохранения (R01DK98263, R01DK115577 и R01DK100689) и Департамента здравоохранения штата Нью-йорк в качестве основного директора одноклеточной геномики Эйнштейна/Эпигеномики (C029154). К.И. Ито является научным сотрудником Общества лейкемии и лимфомы.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
