본 프로토콜은 인간 단핵구 자극 분석법에 대한 재조합 태그 없는 칼슘 결합 단백질 S100A12 및 이온 유도 올리고머에 대한 정제 방법을 기술한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
본 프로토콜에서, 우리는 면역 세포 자극을 위한 대장균 배양으로부터 인간 칼슘 결합 단백질 S100A12 및 이온 유도 올리고머를 정제하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 대한 단백질 사전 정제및 소수성 상호작용 컬럼의 후속 연마 단계를 포함하는 2단계 크로마토그래피 전략을 기반으로 합니다. 이 전략은 관리 가능한 비용으로 고순도 및 수율의 S100A12 단백질을 생산합니다. 면역 세포에 기능적인 실험에 대 한 결국 잔재 endotoxin 오염 신중 한 모니터링 및 endotoxin 없는 단백질을 얻기 위해 추가 청소 단계를 필요. 내독소 오염의 대다수는 항이온 교환 크로마토그래피에 의해 제외될 수 있습니다. 잔류 오염을 고갈시키기 위해 이 프로토콜은 원심 필터를 사용하여 제거 단계를 설명합니다. 사용 가능한 이온 강도 S100A12에 따라 상이한 호모멀티머로 배열할 수 있다. 구조와 기능 사이의 관계를 조사하기 위해 이 프로토콜은 S100A12 단백질의 이온 처리를 더 설명하고 화학적 가교하여 S100A12 올리고머를 안정화시키고 크기 배제에 의한 후속 분리를 설명합니다. 크로마토그래피. 마지막으로, 우리는 정제된 단백질의 생물학적 활성을 확인하고 LPS 가 없는 제제를 확인하는 세포 기반 분석기를 기술한다.
서론
S100A12는 인간 과립구에 의해 주로 생성되는 칼슘 결합 단백질입니다. 단백질은 (전신) 염증 및 혈청 수준 동안 과발현되며, 특히 전신 성 청소년 특발성 관절염 (sJIA), 가족 지중해 열 (FMF) 또는 가와사키 질환 (KD)과 같은 (자동) 염증성 질환에서 질병 활동 및 치료에 대한 반응. 톨-유사 수용체(TLRs)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR)에 따라, 선천적인 면역 계통은 리포폴리대당(LPS) 또는 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)과 같은 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)에 의해 활성화될 수 있다. '알람'이라고도 불립니다. DAMPs는 세포 단백질, 지질 또는 핵산과 같은 내인성 분자1. DAMP 기능은 칼그라눌린 단백질 패밀리의 구성원인 S100A8/A9 및 S100A122의구성원에 대해 잘 설명되어 있으며, 이는 또한 이원성 금속 이온 킬레이트 화 항균 펩티드로 작동하는 것으로 보고되고3,4 ,4, 5,6. 사용 가능한 이온 강도 S100A12에 따라, ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고: 버퍼 및 재고 솔루션 준비는 보충 표 1을 참조하십시오.
1. 대장균의 단백질 발현
-
복제
- 복제없는 인간 S100A12 (NCBI 기준 서열: NP_005612.1) 박테리아 발현 벡터 pET11b 내로. 단백질을 발현하기 위해, 컨스트럭트를 대장균 BL21(DE3)으로 변형시킨다.
-
문화
- 14 mL 원형 바닥 튜브에서 5 mL의 성장 배지 (100 μg / mL ampicillin를 가진 LB 국물)에서 단일 콜로니를 접종하여 스타터 배양을 준비하십시오. 220 rpm에서 흔들어 37 °C에서 밤새 배양. 2-4 mL의 하룻밤 배양을 2L 에를렌마이어 플라스크에서 400 mL의 성장 배지로 옮기고 220 rpm에서 흔들어 37°C에서 배양을 배양한다.
참고: 주 배양의 초기 밀도는 600 nm(OD600)= 0.1에서 광학 밀도여야 한다. - 성장 하는 동안 OD600모니터링 합니다. OD6....
- 14 mL 원형 바닥 튜브에서 5 mL의 성장 배지 (100 μg / mL ampicillin를 가진 LB 국물)에서 단일 콜로니를 접종하여 스타터 배양을 준비하십시오. 220 rpm에서 흔들어 37 °C에서 밤새 배양. 2-4 mL의 하룻밤 배양을 2L 에를렌마이어 플라스크에서 400 mL의 성장 배지로 옮기고 220 rpm에서 흔들어 37°C에서 배양을 배양한다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
AIEX 컬럼(도1A-C)에대한 사전 정제 에 이어 후속 칼슘 의존성 HIC(그림2A, B)를순차단백질(도2C)으로수득하였다. 또한, 내독소의 측정은 성공적인 LPS 제거를 밝혀. AIEX에 따른 LPS 함량은 분석 검출 한계, 즉 500 EU/mL 를 초과하는 1:10 희석으로 측정되었다. 50 kDa 필터 유닛을 통해 첫 번째 여과 후, LPS 함량은 1 EU/mL로 감소되었다. 3 kDa 필터 유닛과 50 kDa를 통한 추가 여과로 농도를 따라, 측정된 LPS 오염은 0.08 EU/mL이었다.
추가적인 대조군으로서, 인간 단핵구는 생성된 야생형 단백질로 자극되었다(도3A,B).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜에서, 우리는 면역 세포 자극을 위한 다른 이온 유도 된 올리고머로의 분리뿐만 아니라 인간 S100A12의 태그 없는 세균 발현 및 그것의 정제를 기술한다. S100A12 단백질 정제8,23,24에대한 출판 된 문헌과 비교하여 소수성 상호 작용 크로마토그래피에서 높은 CaCl2 (25 mM)를 사용하는 것은 우리의 지식고유입니다. 1 내지 5 mM의 농도를 적용하는 몇몇 프로토콜은 순수한 단백질을 생성하지만, 대신 25 mM CaCl2를 사용하는 우리의 접근 방식에 따라 몇 배 더 높은 수율을 관찰했습니다. 이것은 컬럼 물질과의 단백질 상호 작용의 계층구조에 의해 설명될 수 있습니다:S100A12는 컬럼 물질에 직접 결합할 수 있습니다 그러나Ca2+의 과잉은 또한 이미 컬럼 결합단백질에
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 연구는 Muenster 대학 의학 교수의 교내 혁신적인 의학 연구 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다 (KE121201 C.K.에) 독일 연구 재단 (DFG, Fo354/3-1 D.F.)
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pET11b 벡터 | Novagen | ||
| BL21(DE3) 유능한 E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x 비필수 아미노산 | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4− 20% Mini-PROTEAN TGX 단백질 겔 | BioRad | 4561093 | |
| 암피실린 나트륨 염 | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3(bis(sulfosoxynimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 염색 용액 | BioRad | 1610436 | |
| EasySep 인간 단핵구 농축 키트 | Stemcell | 19059 | 자기 음성 세포 분리 키트 |
| EDTA 이나트륨 염 이수화물 | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin 검출 |
| 분석 Endotoxin-Free Ultra Pure | Water Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Endoxin-free 완충액 준비를 위한 초순수 |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin 제거 수지 |
| FBS(열 비활성화) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (고품질, 내독소 testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-글루타민 (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| E. coli O55:B5의 리포다당 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | 분리 용액(밀도 구배 원심분리) |
| 페니실린/스트렙토마이신(10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| 페닐 세파로스 고성능 | GE 헬스케어 | 17-1082-01 | 수지 소수성 상호 작용 크로마토그래 |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| 프로테아제 억제제 정제 | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | 음이온 교환 크로마토그래피용 수지 |
| RoboSep 완충액 | Stemcell | 20104 | 세포 분리 완충액(섹션 5.1.4) |
| RPMI 1640 중간 | Merck | F 1215 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| 수산화 나트륨 | Carl Roth | P031.1 | |
| 트리스 염기 | Carl Roth | 4855.3 | |
| 염화아연 | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 &마이크로; m 주사기 필터 | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom 튜브 | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer 플라스크 | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 웰 서스펜션 플레이트 | Greiner | 662102 | |
| 5 L 측정 비커 | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL 원추형 원심분리기 튜브 | Corning | 430829 | |
| 50 mL 고속 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛 MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛 MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| 투석 튜빙 클로저 | 스펙트럼 | 132738 | |
| EasySep 자석 'The Big Easy' | 스템셀 | 18001 | |
| 분획 수집기 튜브 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox 필름, 25 µ m, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | 단핵구 배양 플레이트용 필름 |
| Spectra/Por 투석 멤브레인 (3.5 kDa) | 스펙트럼 | 132724 | |
| Steritop 필터 유닛 | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 ° C 인큐베이터(쉐이킹 포함) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| Ä KTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC 시스템 | |
| 분획 분취기 | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| 형광 리더 | Tecan | 무한 M200PRO | |
| pH 측정기 | Knick | 765 |
참고문헌
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phago....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
