Purificazione di Human S100A12 e delle sue Oligomeri indotte dallo ione per la stimolazione cellulare immunitaria
Summary
Questo protocollo descrive un metodo di purificazione per la proteina ricombinante di legame del calcio senza tag S100A12 e i suoi oligomeri indotti dagli ioni per i saggi di stimolazione monocite umana.
Abstract
In questo protocollo, descriviamo un metodo per purificare la proteina che lega il calcio umano S100A12 e i suoi oligomeri indotti dagli oligomeri di Escherichia coli per la stimolazione delle cellule immunitarie. Questo protocollo si basa su una strategia di cromatografia in due fasi, che comprende la pre-purificazione delle proteine su una colonna di cromatografia di scambio di anioni e un successivo passo di lucidatura su una colonna di interazione idrofobica. Questa strategia produce proteine S100A12 ad alta purezza e resa a costi gestibili. Per i test funzionali sulle cellule immunitarie l’eventuale contaminazione da endotossina residua richiede un attento monitoraggio e ulteriori passaggi di pulizia per ottenere proteine prive di endotossina. La maggior parte delle contaminazioni da endotossina può essere esclusa dalla cromatografia di scambio di anioni. Per esaurire le contaminazioni residue, questo protocollo descrive una fase di rimozione con filtri centrifughi. A seconda della forza io-resistenza disponibile S100A12 può organizzare in diversi omomultimer. Per studiare il rapporto tra struttura e funzione, questo protocollo descrive ulteriormente il trattamento io-io della proteina S100A12 seguito dal crosslinking chimico per stabilizzare gli oligomeri S100A12 e la loro successiva separazione per dimensione-esclusione Cromatografia. Infine, descriviamo un saggio basato sulle cellule che conferma l’attività biologica della proteina purificata e conferma la preparazione senza LPS.
Introduction
S100A12 è una proteina legante di calcio che è prevalentemente prodotta da granulociti umani. La proteina è sovraespressa durante l’infiammazione (sistemica) e i suoi livelli di siero, in particolare nelle malattie (auto)infiammatorie come l’artrite idiopatica giovanile sistemica (sJIA), la febbre mediterranea familiare (FMF) o la malattia di Kawasaki (KD) l’attività della malattia e la risposta alla terapia. A seconda dei recettori di riconoscimento dei modelli (PRR), come i recettori a pedaggio (TLR), il sistema immunitario innato può essere attivato da modelli molecolari associati a i patogeni (PPR) come lipopolioaccharides (LPS) o modelli molecolari associati al danno (DAMP; denominato anche “alarmins”). I DAMP sono molecole endogene come proteine cellulari, lipidi o acidi nucleici1. Le funzioni DAMP sono ben descritte per i membri della famiglia di proteine calgranulina, S100A8/A9 e S100A122, che sono anche segnalati per operare come peptides antimicrobico cheonali metallico divalenteleoni 3,4, 5,6. A seconda della forza iologica disponibile S100A12 può, come altri membri della famiglia S100, organizzare in diversi omomultime e fino a poco tempo fa l’impatto di S100A12-oligomerisation sull’interazione PRR, in particolare TLR4, era sconosciuto.
La forma monomerica della proteina (92 aminoacidi, 10,2 kDa) è costituita da due strutture eliche-loop-eliche a mano eF collegate da un linker flessibile. La mano EF -terminale Ccontiene il classico motivo di rilegatura Ca2,mentre la mano EF -terminale Npresenta una struttura a ciclo esteso specifica della proteina S100 (‘pseudo-EF-hand’) e rivela una ridotta affinità Ca2. Il legame di Ca2 xda parte di S100A12 può indurre un importante cambiamento conformazionale nel capolinea Cdelle proteine, che si traduce in un’esposizione di una macchia idrofobica su ciascun monomero e forma l’interfaccia di dimerizzazione. Così, in condizioni fisiologiche, la più piccola struttura quaternaria formata da S100A12 è un dimero non covalente (circa 21 kDa) in cui i singoli monomeri sono in orientamento antiparallelo. Una volta disposto come dimero, S100A12 viene segnalato al sequestro di n2 e ad altri ioni metallici divalenti, ad esempio Cu2, con alta affinità7. Questi ioni sono coordinati all’interfaccia dimero S100A12 da aminoacidi H15 e D25 di una sottounità e H85, nonché H89 dell’anti-paralleling di altre sottounità8,9,10. Mentre gli studi precedenti propongono che l’S100A12 caricato dan.2o 2 può indurre l’organizzazione della proteina in omo-tetrameri (44 kDa) e per provocare un aumento dell’affinità Ca2,12, recente titolazione metallica Gli studi6 suggeriscono che il legame Di Ca2 diS100A12 per aumentare l’affinità della proteina conn. 2. Una volta che le lancette EF S100A12 sono completamente occupate da Ca2o, si pensa che ca2 o più si leghi tra i dimeri, innescando la formazione di esamere (circa 63 kDa). L’architettura della struttura trimestrale hexamica è chiaramente diversa da quella del tetramero. Si propone che l’interfaccia tetramer è interrotta per dare origine a nuove interfacce dimer-dimer che beneficiano la formazione di esagomeri10. S100A12 è quasi esclusivamente espresso da granulociti umani dove costituisce circa il 5% di tutte le proteine citosoliche13. Nella sua funzione DAMP S100A12 è stato storicamente descritto come agonista del recettore multi-ligando per prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE), poi chiamato extracellulare proteina legante RAGE di recente identificata (EN-RAGE)14. Anche se in precedenza abbiamo segnalato biochimica S100A12-legatura sia rage e TLR415, abbiamo recentemente dimostrato monociti umani per rispondere alla stimolazione S100A12 in modo tramite TLR416. Ciò richiede la disposizione di S100A12 nella suastrutturatrimestrale hexameric indotta da Ca2/ n2.
Qui descriviamo una procedura di purificazione per l’uomo ricombinante S100A12 e le sue oligomeri indotte dagli ioni per le stimolazioni delle cellule immunitarie16,17. Questo si basa su una strategia di cromatografia in due fasi, che inizialmente include una colonna di scambio di anioni per isolare e concentrare la proteina e rimuovere le contaminazioni sfuse (ad esempio, endotossine/lipopolysaccharides)18. Le resine di cromatografia dello scambio io-scie separano le proteine sulla base di diverse cariche nette di superficie. Per le proteine acide come S100A12 (punto isoelettrico di 5.81), un sistema di tampone con un pH di 8,5 e una forte resina di scambio di anion porta ad una buona separazione. Le proteine legate sono state eluite con un gradiente tampone ad alto contenuto di sale. Con un aumento degli ioni negativi di forza ionica nel tampone di eluizione competere con le proteine per le cariche sulla superficie della resina. Le proteine si eludono individualmente a seconda della loro carica netta e in conseguenza di ciò, i tamponi descritti qui permettono di isolare e concentrare la proteina S100A12 sovraespressa. A causa di gruppi caricati negativamente nei lipopolioaccharide, queste molecole si legano anche alle resine di scambio di anioni. Tuttavia, la loro maggiore carica netta si traduce in una successiva eluizione nel gradiente ad alto sale applicato. La seconda fase della procedura di purificazione è stata introdotta a i fini della lucidatura. Questo fa uso della capacità di legame del calcio di S100A12 e rimuove le impurità rimanenti su una colonna di interazione idrofobica. Il legame di calcio di S100A12 porta a un cambiamento conformazionale e ad un’esposizione di macchie idrofobiche sulla superficie della proteina. A tale condizione, S100A12 interagisce con la superficie idrofobica della resina. Al momento del chelante di calcio da parte di EDTA, questa interazione è invertita. In presenza di ioni, in particolare calcio e zinco, S100A12 si organizza in oligomeri ommerici. Per studiare le relazioni struttura-funzione dei diversi oligomeri, abbiamo stabilizzato la cromatoria dimericica, tetramerica e hexamcumso S100A12 con un crosslinker chimico e abbiamo separato i complessi su una colonna cromatografica di dimensioni-esclusione. Infine, per analizzare la funzionalità e l’attività biologica della proteina purificata e dei suoi oligomeri indotti dagli ioni, è possibile confrontare il rilascio di citochina del monocito stimolato S100A12 e del monocito stimolato LPS.
Finora sono stati descritti vari metodi per purificare S100A12. Jackson et al.19, per esempio, ha pubblicato un protocollo con purificazione tramite una colonna di scambio di anion e una successiva cromatografia di esclusione di dimensioni. La purificazione in una colonna di esclusione delle dimensioni porta a buoni risultati, ma, ad esempio a causa dei volumi di carico limitati, è meno flessibile in termini di scalabilità. Un approccio diverso, pubblicato da Kiss et al.20, descrive la purificazione delle proteine marcate tramite la colonna di affinità Ni2 come primo passaggio di purificazione, seguito da scissione enzimatica per rimuovere il tag e ulteriori passaggi di purificazione. In contrasto con gli studi foriciti19,20, la proteina prodotta come descritto in questo protocollo è determinata per esperimenti sulle cellule immunitarie. Pertanto, la contaminazione da endotossina residua dalla coltura batterica è una sfida. Anche se finora sono stati descritti diversi approcci per la rimozione dell’endotossina, non esiste un metodo uniforme che funzioni altrettanto bene per una determinata soluzione proteica21,22.
In sintesi, il nostro protocollo combina i vantaggi di un’espressione senza tag in un sistema batterico con un’efficiente rimozione dell’endotossina e un alto rendimento di proteine pure.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, descriviamo l’espressione batterica priva di tag dell’uomo S100A12 e la sua purificazione, nonché la separazione in diversi oligomeri indotti dagli ioni per la stimolazione delle cellule immunitarie. Rispetto alla letteratura pubblicata sulla purificazione della proteina S100A128,23,24, l’uso dell’alto CaCl2 (25 mM) nella cromatografia di interazione idrofobica è a nostra conoscenza unica. Dive…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del programma di ricerca medica innovativo intramurale della facoltà di medicina dell’Università Muenster (da KE121201 a C.K.) e della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG, Fo354/3-1 a D.F.).
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
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