Purificação do S100A12 humano e seus Oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha

Summary

Este protocolo descreve um método da purificação para a proteína obrigatória tag-livre de recombinação do cálcio S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos para ensaios humanos da estimulação do monocyte.

Abstract

Neste protocolo, nós descrevemos um método para purificar a proteína cálcio-obrigatória humana S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos da cultura de Escherichia coli para estimulações imunes da pilha. Este protocolo baseia-se em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que compreende a pré-purificação de proteínas em uma coluna de cromatografia de troca de ânions e uma etapa de polimento subsequente em uma coluna de interação hidrofóbica. Esta estratégia produz S100A12 proteína de alta pureza e rendimento a custos gerenciáveis. Para ensaios funcionais em células imunes eventual contaminação de endotoxina remanescente requer monitoramento cuidadoso e mais etapas de limpeza para obter proteína livre de endotoxina. A maioria das contaminações da endotoxina pode ser excluída por cromatografia de troca de ânions. Para esgotar contaminações residuais, este protocolo descreve uma etapa da remoção com filtros centrífugos. Dependendo do íon-força disponível S100A12 pode arranjar em homomultimers diferentes. Para investigar o relacionamento entre a estrutura e a função, este protocolo descreve mais mais o íon-tratamento da proteína S100A12 seguida pelo reticulação químico para estabilizar S100A12 oligômeros e sua separação subseqüente pelo tamanho-exclusão Cromatografia. Finalmente, nós descrevemos um ensaio Cell-Based que confirme a atividade biológica da proteína purified e confirme a preparação LPS-livre.

Introduction

S100A12 é uma proteína de ligação de cálcio que é predominantemente produzida por granulócitos humanos. A proteína é superexpressa durante a inflamação (sistêmica) e seus níveis séricos, particularmente em (auto) doenças inflamatórias como a artrite idiopática juvenil sistêmica (Aijs), a febre familiar do Mediterrâneo (FMF) ou a doença de Kawasaki (KD) pode informar sobre atividade da doença e resposta à terapêutica. Dependendo dos receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), como os receptores Toll-like (TLRs), o sistema imunológico inato pode ser ativado por padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), como lipopolissacarídeos (LPS) ou danos associados a padrões moleculares (DAMPs; também denominado ‘ alarmins ‘). Os DAMPs são moléculas endógenas, como proteínas celulares, lipídios ou ácidos nucleicos¹. As funções húmidas são bem descritas para os membros da família de proteínas calgranulina, S100A8/A9 e S100A12^{2, que}também são relatados para operar como peptídeos antimicrobianos de quelação^{de íons}metálicos divalentes^{3,4, 5,6}. Dependendo da força disponível do íon S100A12 lata, como outros membros da família S100, arranja em homomultimers diferentes e até recentemente o impacto de S100A12-oligomerisation no PRR-interação, particular TLR4, era desconhecido.

A forma monomérica da proteína (92 aminoácidos, 10,2 kDa) consiste em duas estruturas de hélice-loop-hélice da EF-mão conectadas por um vinculador flexível. O C-Terminal EF-Hand contem o clássico CA^{2 +}-o motivo obrigatório visto que o N-Terminal EF-Hand exibe uma estrutura prolongada proteína-específica do laço S100 (‘ pseudo-EF-mão ‘) e revela a afinidade reduzida de CA^{2 +}-. CA^{2 +}-a ligação por S100A12 pode induzir uma mudança conformacional principal no C-Terminus das proteínas, que conduz à exposição de um remendo hydrofóbico em cada monómero e dá forma à relação do dimerização. Assim, condições fisiológicas, a menor estrutura quaternária formada por S100A12 é um dímero não covalente (aproximadamente 21 kDa), no qual os monómeros individuais estão em orientação antiparalela. Quando arranjado como dímero, S100A12 é relatado para seqüestro Zn^{2 +} , bem como outros íons metálicos divalentes, por exemplo,^{2 +} com alta afinidade⁷. Estes íons são coordenados na interface de dímero S100A12 por aminoácidos h15 e D25 de uma subunidade e H85, bem como H89 da antiparalelante outra subunidade^8,9,10. Enquanto estudos anteriores propõem que Zn^{2 +}-carregado S100A12 pode induzir a organização da proteína em Homo-tetramers (44 kDa) e para resultar em aumento CA^{2 +}-afinidade^11,12, recente titulação de metal estudos⁶ sugerem CA^{2 +}-ligação por S100A12 para aumentar a afinidade da proteína para Zn^{2 +}. Uma vez que os S100A12 EF-hands são ocupados inteiramente por CA^{2 +}, o CA adicional^{2 +} é pensado para ligar entre dímeros, provocando a formação do hexamer (aproximadamente 63 kDa). A arquitetura da estrutura quarternary forma é claramente diferente daquela do tetramer. Propõe-se que a interface do tetrâmero é interrompida para dar origem a novas interfaces dímero-dímero que beneficia a formação de hexamer¹⁰. S100A12 é quase exclusivamente expresso por granulócitos humanos, onde constitui cerca de 5% de toda a proteína citosólica¹³. Em sua função úmida S100A12 foi historicamente descrita como agonista do receptor multiligante para produtos finais de glicação avançada (RAGE), então denominado proteína de ligação à raiva recém-identificada extracelular (EN-RAGE)¹⁴. Embora nós relatado mais cedo S100A12-ligação bioquímica a Rage e a TLR4¹⁵, Nós demonstramos recentemente monócitos humanos para responder à estimulação S100A12 em uma maneira TLR4-dependente¹⁶. Isto exige o arranjo de S100A12 em seu ca^{2 +}/Zn^{2 +}-estrutura quarternary forma induzida¹⁶.

Aqui nós descrevemos um procedimento da purificação para o S100A12 humano de recombinação e seus oligômeros íon-induzidos para estimulações imunes da pilha^16,17. Isso se baseia em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que inicialmente inclui uma coluna de troca de ânions para isolar e concentrar a proteína e remover contaminações em massa (por exemplo, endotoxinas/lipopolissacarídeos)¹⁸. Resinas de cromatografia de troca iónica separam proteínas com base em diferentes encargos de superfície líquida. Para proteínas ácidas como S100A12 (ponto isoelétrico de 5,81), um sistema tampão com um pH de 8,5 e uma resina de troca aniónica forte leva a uma boa separação. As proteínas ligadas foram eluidas com um gradiente de tampão de alto sal. Com um aumento de íons negativos de força iônica no tampão de eluição competir com proteínas para cargas na superfície da resina. Proteínas individualmente eluir dependendo de sua carga líquida e em conseqüência disso, os bufferes descritos nisto permitem isolar e concentrar a proteína S100A12 overexpressada. Devido a grupos carregados negativamente em lipopolissacarídeos, essas moléculas também se ligam a resinas de troca de ânions. Entretanto, sua carga líquida mais elevada conduz à eluição mais atrasada no inclinação elevado-sal aplicado. A segunda etapa do procedimento de purificação foi introduzida para fins de polimento. Isto faz uso da capacidade de ligação de cálcio de S100A12 e remove as impurezas remanescentes em uma coluna de interação hidrofóbica. O emperramento do cálcio de S100A12 conduz a uma mudança conformacional e a uma exposição de remendos hydrofóbicos na superfície da proteína. Nessa condição, S100A12 interage com a superfície hidrofóbica da resina. Em cima do cálcio-quelante pelo EDTA, esta interação é invertida. Na presença de íons, especialmente cálcio e zinco, S100A12 organiza em oligomers condição. Para estudar relações estrutura-função dos oligomers diferentes, nós estabilizamos o dimeric, tetramérica e o S100A12 de recombinação forma com um chapéu cabeado químico e separamos os complexos em uma coluna da cromatografia do tamanho-exclusão. Finalmente, para analisar a funcionalidade e a atividade biológica da proteína purificada e seus oligomers íon-induzidos, a liberação do citocinas de S100A12 e de LPs estimulou o monocyte pode ser comparada.

Os vários métodos para purificante S100A12 foram descritos até agora. Jackson et al.¹⁹, por exemplo, publicaram um protocolo com purificação por meio de uma coluna de troca de ânions e uma posterior cromatografia de exclusão de tamanho. O polimento de purificação em uma coluna de exclusão de tamanho leva a bons resultados, mas ― devido a, por exemplo, volumes de carregamento limitados ― é menos flexível na escalabilidade. Uma abordagem diferente, publicada por Kiss et al.²⁰, descreve a purificação da proteína etiquetada via coluna Ni^{2 +} Affinity como a primeira etapa de purificação, seguida de clivagem enzimática para remover a tag e outras etapas de purificação. Em contraste com os estudos aforecited^{19,20, a}proteína produzida como descrito neste protocolo é determinada para experiências em pilhas imunes. Conseqüentemente, a contaminação remanescente da endotoxina da cultura bacteriana é um desafio. Embora diferentes abordagens para a remoção da endotoxina tenham sido descritas até o momento, não há um método uniforme que funcione igualmente bem para qualquer solução protéica^21,22.

Em resumo, nosso protocolo combina as vantagens de uma expressão tag-free em um sistema bacteriano com remoção eficiente da endotoxina e elevado rendimento da proteína pura.

Protocol

Nota: Por favor, consulte a tabela complementar 1 para preparação de buffers e soluções de estoque. 1. expressão protéica em E. coli Clonagem Clone tag-free Human S100A12 (seqüência de referência NCBI: NP_ 005612.1) em vetor de expressão bacteriana pET11b. Para expressar a proteína, transforme a construção em E. coli BL21 (de3). Cultura Prepa…

Representative Results

Após a pré-purificação na coluna AIEX (Figura 1a-C) e subsequente HIC dependente de cálcio (Figura 2a, B), obteve-se proteína altamente pura (Figura 2C). Além, as medidas do endotoxina revelaram a remoção bem sucedida dos LPS. O teor de LPS após AIEX foi medido numa diluição de 1:10 acima do limite de detecção do ensaio, ou seja, acima de 500 EU/mL. Após a primeira filtração atravé…

Discussion

Neste protocolo, nós descrevemos a expressão bacteriana tag-livre do S100A12 humano e de sua purificação assim como a separação em oligômeros íon-induzidos diferentes para a estimulação imune da pilha. Comparado à literatura publicada na purificação da proteína S100A12^8,23,24, o uso de CAcl elevado₂ (25 milímetros) na cromatografia hydrofóbica-interação é a nosso conhecimento original. Vários proto…

Materials

pET11b vector	Novagen
BL21(DE3) competent E. coli	New England Biolabs	C2527
100 x Non-essential amino acids	Merck	K 0293
25% HCl	Carl Roth	X897.1
4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels	BioRad	4561093
Ampicillin sodium salt	Carl Roth	HP62.1
BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg	ThermoFisher Scientific	21580
Calciumchlorid Dihydrat	Carl Roth	5239.1
Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution	BioRad	1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution	BioRad	1610436
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit	Stemcell	19059	Magnetic negative cell isolation kit
EDTA disodium salt dihydrate	Carl Roth	8043.1
EGTA	Carl Roth	3054.3
EndoLISA	Hyglos	609033	Endotoxin detection assay
Endotoxin-Free Ultra Pure Water	Sigma-Aldrich	TMS-011-A	Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers
EndoTrap red	Hyglos	321063	Endotoxin removal resin
FBS (heat-inactivated)	Gibco	10270
HBSS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14175053
Hepes	Carl Roth	9105
Hepes (high quality, endotoxin testet)	Sigma-Aldrich	H4034
hTNF-alpha – OptEia ELISA Set	BD	555212
IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid)	Carl Roth	CN08.1
L-Glutamine (200 mM)	Merck	K 0282
LB-Medium	Carl Roth	X968.1
Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5	Merck	L6529
Pancoll, human	PAN Biotech	P04-60500	Separation solution (density gradient centrifugation)
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)	Merck	A 2212
Phenyl Sepharose High Performance	GE Healthcare	17-1082-01	Resin for hydrophobic interaction chromatography
Polymyxin B	Invivogen	tlrl-pmb
Protease inhibitor tablets	Roche	11873580001
Q Sepharose Fast Flow	GE Healthcare	17-0510-01	Resin for anion-exchange chromatography
RoboSep buffer	Stemcell	20104	Cell separation buffer (section 5.1.4)
RPMI 1640 Medium	Merck	F 1215
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	3957.2
Sodium hydroxide	Carl Roth	P031.1
Tris Base	Carl Roth	4855.3
Zinc chloride	Carl Roth	T887
Labware
0,45 µm syringe filter	Merck	SLHA033SS
14 mL roundbottom tubes	BD	352059
2 L Erlenmyer flask	Carl Roth	LY98.1
24 well suspension plates	Greiner	662102
5 L measuring beaker	Carl Roth	CKN3.1
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430829
50 mL high-speed centrifuge tubes	Eppendorf	3,01,22,178
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa	Merck	UFC900324
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa	Merck	UFC905024
Culture dish (100 mm)	Sarstedt	83.3902
Dialysis Tubing Closures	Spectrum	132738
EasySep magnet 'The Big Easy`	Stemcell	18001
Fraction collector tubes 5 mL	Greiner	115101
Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m	Sarstedt	94,60,77,316	Film for monocyte culture plates
Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)	Spectrum	132724
Steritop filter unit	Merck	SCGPT01RE
Equipment
37 °C Incubator (with shaking)	New Brunswick Scientific	Innova 42
ÄKTA purifier UPC 10	GE Healthcare		FPLC System
Fraction collector	GE Healthcare	Frac-920
Centrifuge (with rotor A-4-81)	Eppendorf	5810R
Fixed angle rotor	Eppendorf	F-34-6-38
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658000EDU
NanoPhotometer	Implen	P330
Sonicator	Brandelin	UW2070
Fluorescence reader	Tecan	infinite M200PRO
pH meter	Knick	765