İnsan S100A12 ve Bağışıklık Hücre Stimülasyonu için Iyon kaynaklı Oligomerlerin Saflaştırılması
Summary
Bu protokol, rekombinant etiketsiz kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 ve insan monosit stimülasyonu tahlilleri için iyonkaynaklı oligomerler için bir arıtma yöntemini tanımlar.
Abstract
Bu protokolde, bağışıklık hücresi stimülasyonu için Escherichia coli kültüründen insan kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 ve iyon kaynaklı oligomerleri arındırmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, bir aniyon değişimi kromatografisi sütununda protein ön arıtma ve hidrofobik etkileşim sütununda bir sonraki parlatma adımlarını içeren iki aşamalı bir kromatografi stratejisine dayanmaktadır. Bu strateji yönetilebilir maliyetlerle yüksek saflıkta ve verim S100A12 protein üretir. Bağışıklık hücreleri nihai kalıntı endotoksin kontaminasyonfonksiyonel tahliller için endotoksin içermeyen protein elde etmek için dikkatli izleme ve daha fazla temizlik adımları gerektirir. Endotoksin kontaminasyonlarının çoğu aniyon değişimi kromatografisi ile dışlanabilir. Artık kontaminasyonları tüketmek için, bu protokol santrifüj filtreleri ile bir kaldırma adımı açıklar. Mevcut iyon gücüne bağlı olarak S100A12 farklı homomultimerler içine düzenleyebilirsiniz. Yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi araştırmak için, bu protokol s100A12 proteininin iyon tedavisini ve ardından S100A12 oligomerlerini stabilize etmek için kimyasal crosslinking’i ve bunların boyut-dışlanma ile ayrılmasını tanımlar. Kromatografi. Son olarak, saflaştırılmış proteinin biyolojik aktivitesini doğrulayan ve LPS içermeyen hazırlığı doğrulayan hücre bazlı bir test tanımlıyoruz.
Introduction
S100A12 ağırlıklı olarak insan granülositleri tarafından üretilen kalsiyum bağlayıcı bir proteindir. Protein (sistemik) inflamasyon sırasında aşırı ifade edilir ve serum düzeyleri, özellikle sistemik juvenil idiyopatik artrit (sJIA), ailesel Akdeniz ateşi (FMF) veya Kawasaki hastalığı (KD) gibi (oto)inflamatuar hastalıklar hakkında bilgi verebilir hastalık aktivitesi ve tedaviye yanıt. Toll benzeri reseptörler (TLR) gibi örüntü tanıma reseptörlerine (PrR) bağlı olarak, doğuştan gelen bağışıklık sistemi lipopolisakkaritler (LPS) veya hasar ilişkili moleküler desenler (DAMP) gibi patojen ilişkili moleküler desenler (PAMP’ ler) tarafından aktive edilebilir; ayrıca ‘alarmins’ olarak da adlandırılır). DAMP’lar hücresel proteinler, lipidler veya nükleikasitler1 gibi endojen moleküllerdir. DAMP fonksiyonları iyi calgranulin protein ailesinin üyeleri için tarif edilir, S100A8/A9 ve S100A122, ayrıca divalent metal iyon-şelat antimikrobiyal peptidler 3 olarak faaliyet bildirilmiştir3,4, 5,6. Mevcut iyon gücüne bağlı olarak S100A12, S100 ailesinin diğer üyeleri gibi, farklı homomultimerler içine düzenlemek ve yakın zamana kadar PRR-etkileşim, özellikle TLR4 s100A12-oligomerizasyon etkisi bilinmemektedir.
Proteinin monomerik formu (92 amino asit, 10.2 kDa) esnek bir bağlayıcı ile birbirine bağlanan iki EF-el sarlis-döngü-sarlis yapılarından oluşur. C-terminal EF-eli klasik Ca2+-bağlayıcı motifiçerirken, N-terminalEF-eli S100 proteine özgü genişletilmiş döngü yapısını (‘pseudo-EF-hand’) sergiler ve azaltılmış Ca2+-yakınlığı ortaya çıkarır. Ca2+-S100A12 ile bağlanma proteinlerin C-terminus’unda büyük bir konformasyonel değişikliğe neden olabilir, bu da her monomerde hidrofobik bir yamanın maruz kalmasına neden olur ve dimerizasyon arayüzünü oluşturur. Bu nedenle, fizyolojik koşullar altında, S100A12 tarafından oluşturulan en küçük kuaternary yapı, tek tek monomerlerin antiparalel yönde olduğu kovalent olmayan bir dimer (yaklaşık 21 kDa) dir. Dimer olarak düzenlendiğinde, S100A12 sequester Zn2 + yanı sıra diğer divalent metal iyonları bildirilmiştir, örneğin, Cu2 + yüksek yakınlık ile7. Bu iyonlar S100A12 dimer arabiriminde bir alt birim ve H85 amino asitleri H15 ve D25 yanı sıra anti-paralel diğer alt birim8,9,10H89 tarafından koordine edilir. Daha önceki çalışmalarz Zn2 +yüklü S100A12 homo-tetramer (44 kDa) içine protein organizasyonu neden olabilir ve artmış Ca2 +-afinite11,12, son metal titrasyon neden olabileceğini öne süre çalışmalar6 Zn2 +proteinin afinitesini artırmak için S100A12 tarafından Ca 2+-bağlayıcı öneririz. S100A12 EF-hands tamamen Ca 2+tarafından işgal edildikten sonra, ek Ca2 + dimers arasında bağlamak için düşünülmektedir, hexamer oluşumunu tetikleyen (yaklaşık 63 kDa). Hexameric quarternary yapısının mimarisi tetramerin mimarisinden açıkça farklıdır. Tetramer arabiriminin, hexamerformasyonu 10’afayda sağlayan yeni dimer-dimer arabirimlerine yol vermek için bozulduğu öne sürüldü. S100A12 neredeyse sadece insan granülositler tarafından ifade edilir nerede tüm sitosolik protein13yaklaşık% 5 oluşturmaktadır. Onun DAMP fonksiyonu nda S100A12 tarihsel gelişmiş glisasyon son ürünler için multi-ligand reseptöragonist olarak tarif edildi (RAGE), sonra ekstrasellüler yeni tanımlanan RAGE bağlayıcı protein denir (EN-RAGE)14. Daha önce hem RAGE hem de TLR415için biyokimyasal S100A12-bağlayıcı rapor olsa da, biz son zamanlarda bir TLR4 bağımlı şekilde S100A12 stimülasyon yanıt insan monositler gösterdi16. Bunun için S100A12’nin Ca2+/Zn2+indüklenen hexameric quarternary yapısına düzenlenmesigerekmektedir 16.
Burada rekombinant insan S100A12 ve bağışıklık hücresi stimülasyonu için iyon kaynaklı oligomerler için bir arıtma prosedürü tarif16,17. Bu iki aşamalı kromatografi stratejisine dayanmaktadır, başlangıçta izole etmek ve protein konsantre ve toplu kontaminasyonkaldırmak için bir aniyon değişimi sütun içeren (örneğin, endotoksinler / lipopolisakkaritler)18. İon-exchange kromatografi resinleri farklı net yüzey yükleri temelinde ayrı proteinler. S100A12 (izoelektrik nokta 5.81), pH ile bir tampon sistemi 8.5 ve güçlü bir aniyon değişimi reçine gibi asidik proteinler için iyi bir ayırma yol açar. Bağlı proteinler yüksek tuz tampon gradyanı ile eluted edildi. Elüsyon tamponundaki iyonik mukavemetartışı ile negatif iyonlar rezorin yüzeyindeki yükler için proteinlerle rekabet eder. Proteinler net yüklerine bağlı olarak ayrı ayrı eute ve bunun sonucu olarak, burada açıklanan tamponlar aşırı ifade edilen S100A12 proteinini izole edip konsantre etmelerine olanak sağlar. Lipopolisakkaritlerde negatif yüklü gruplar nedeniyle, bu moleküller de aniyon değişimi reçineler bağlanır. Ancak, onların yüksek net şarj uygulanan yüksek tuz gradyan daha sonra elüsyon sonuçlanır. Arınma prosedürünün ikinci adımı parlatma amacıyla getirilmiştir. Bu, S100A12’nin kalsiyum bağlama yeteneğini kullanır ve hidrofobik etkileşim sütununda kalan yabancı maddeleri ortadan kaldırır. S100A12 kalsiyum bağlanması konformasyonel değişime ve protein yüzeyinde hidrofobik yamalar maruz kalmasına yol açar. Bu durumda, S100A12 resenin hidrofobik yüzeyi ile etkileşime girer. EDTA tarafından kalsiyum-şelat üzerine, bu etkileşim tersine çevrilir. S100A12, başta kalsiyum ve çinko olmak üzere iyonların varlığında homomerik oligomerlere dönüşür. Farklı oligomerlerin yapı-fonksiyon ilişkilerini incelemek için dimerik, tetramerik ve hexameric rekombinant S100A12’yi kimyasal bir çapraz bağlantı ile stabilize ettik ve kompleksleri boyut dışlama kromatografisi sütununda ayırdık. Son olarak, saflaştırılmış proteinin ve iyonkaynaklı oligomerlerin işlevselliğini ve biyolojik aktivitesini analiz etmek için, S100A12 ve LPS uyarılmış monositin sitokin salınımı karşılaştırılabilir.
S100A12’yi arındırmak için şimdiye kadar çeşitli yöntemler tanımlanmıştır. Jackson ve ark.19, örneğin, bir aniyon değişimi sütun ve sonraki boyut dışlama kromatografisi yoluyla arınma ile bir protokol yayınladı. Boyut dışlama sütununda saflaştırma parlatma iyi sonuçlar doğurur, ancak örneğin sınırlı yükleme hacimleri―ölçeklenebilirlik açısından daha az esnektir. Kiss ve ark.20tarafından yayınlanan farklı bir yaklaşım, etiketli proteinin Ni2+ yakınlık sütunu üzerinden saflaştırılmasını ilk saflaştırma adımı olarak tanımlar, ardından etiketi ve daha fazla saflaştırma adımını çıkarmak için enzimatik bölünme yi takip eder. Önseki çalışmaların aksine19,20, bu protokolde açıklandığı gibi üretilen protein bağışıklık hücreleri üzerinde deneyler için belirlenir. Bu nedenle, bakteri kültüründen kalıntı endotoksin kontaminasyonu bir meydan okumadır. Endotoksin çıkarılması için farklı yaklaşımlar şimdiye kadar tarif edilmiş olmasına rağmen, herhangi bir protein çözeltisi için eşit derecede iyi çalışan bir yöntem yoktur21,22.
Özetle, protokolümüz bir bakteri sisteminde etiketsiz ifadenin avantajlarını verimli endotoksin giderme ve yüksek saf protein verimi ile birleştirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, insan S100A12 etiketsiz bakteriyel ekspresyonu ve saflaştırma yanı sıra bağışıklık hücresi stimülasyonu için farklı iyon kaynaklı oligomerler içine ayırma açıklar. S100A12 protein arınması8,23,24üzerine yayınlanan literatürile karşılaştırıldığında hidrofobik etkileşim kromatografisinde yüksek CaCl2 (25 mM) kullanımı bilgimize özgüdür. 1 ila 5 mM arasında konsantras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Muenster Üniversitesi tıp fakültesi (KE121201-C.K.) ve Alman Araştırma Vakfı’nın (DFG, Fo354/3-1’den D.F.)’e intramural yenilikçi tıbbi araştırma programı tarafındandesteklenmiştir.
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. . Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. . Application Note – Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation – The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
