हिस्टोलॉजिकल परीक्षा और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए इंटीग्रल ऑकुलर सतह ऊतक प्राप्त करने के लिए बरकरार नेत्रगोलक का अलगाव
Summary
इस प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत बरकरार स्थिति में पलक, नेत्र सतह, पूर्वकाल और पीछे के क्षेत्रों के साथ माउस नेत्रगोलक के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
नेत्र सतह (ओएस) तीन जुड़े भागों के साथ एक उपकला शीट के होते हैं: palpebral कंजक्टिवा, बुलबार कंजक्टिवा और कॉर्निया उपकला। ओएस के विघटन से केराटाइटिस, नेत्रश्लेष्मलाशोथ या दोनों (केराटोकॉन्क्टिवाइटिस) हो जाएगा। कुछ आनुवंशिक संशोधनों या कृत्रिम संचालन के साथ प्रयोगात्मक पशु मॉडल में, यह समानांतर में प्रत्येक भाग के सापेक्ष pathogenetic परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए ओएस उपकला शीट के सभी भागों की जांच करने के लिए उपयोगी है। हालांकि, विरूपण या क्षति के बिना एक पूरे के रूप में ओएस ऊतक के विच्छेदन चुनौतीपूर्ण रहा है, मुख्य रूप से शारीरिक रूप से अलग अभी तक चल पलकें और पलकें और पलकें चिपका ओएस की कोमलता और पतला होने के कारण. इसके अतिरिक्त, हार्ड खोपड़ी/कक्षीय हड्डियों द्वारा बनाई गई गहरी आंख सॉकेट पूरी तरह से आंखों के द्वारा कब्जा कर लिया जाता है जिससे विच्छेदन के संचालन के लिए सीमित स्थान मिल जाता है। नतीजतन, चेहरे की ओर से जुड़े ओएस ऊतकों के साथ आंखों की गेंद के प्रत्यक्ष विच्छेदन अक्सर ऊतक नुकसान के लिए नेतृत्व करेंगे, विशेष रूप से palpebral और bulbar कंजक्टिवा. इस प्रोटोकॉल में, हमने खोपड़ी और कक्षीय हड्डियों को क्रमिक रूप से एक द्वि-सेक्टेड माउस सिर से हटाने के लिए एक विधि का वर्णन किया है, जिससे पलकें, नेत्र सतह, लेंस और रेटिना पूरी तरह से एक टुकड़े में छोड़ दिए जाते हैं। ओएस शीट की अखंडता अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था और एक ही खंड में ऊतक विज्ञान या इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा जांच की जा सकती है।
Introduction
नेत्र सतह में क्षेत्रीय उपकला की एक सतत शीट होती है जिसमें पैल्पेब्रल कंजक्टिवा , बुलबार कंजक्टिवा और कॉर्निया1शामिल हैं . कई ग्रंथियों की संरचना नेत्र सतह उपकला से जुड़ी होती है और साथ में आंसू की एक परत उत्पन्न करती है जो कॉर्निया की सतह को सुखाने और पर्यावरणके आक्रमण2से बचाती है . ओएस के विघटन से केराटाइटिस, नेत्रश्लेष्मलाशोथ या दोनों (केराटोकॉन्क्टिवाइटिस) हो जाएगा। आनुवंशिक कारक और पर्यावरण संबंधी परेशानियाँ या उनकी बातचीत , दोनों ही ओएस3,4के रोगात्मक परिवर्तन में योगदान देते हैं . तदनुसार, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर और शारीरिक या रासायनिक रूप से प्रेरित पशु मॉडल की एक किस्म मानव ओएस की रोग प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
संरचना और माउस ओएस के समारोह में कई मायनों में मनुष्य के समान है. नेत्र ग्रंथियों द्वारा स्रावित आंसू फिल्म घटकों भी चूहों और मनुष्यों के बीच समान हैं. मानव ओएस रोगों के स्पष्ट तंत्र5,6,7 के लिए माउस मॉडलों का उपयोग करके अध्ययन ों का खजाना आयोजित किया गयाहै. कई अवसरों में, यह एक ही प्रयोगात्मक उपचार के तहत व्यापक जानकारी हासिल करने के लिए ओएस के स्थानीय आणविक परिवर्तन के बजाय वैश्विक विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, ओएस के प्रत्येक भाग को एक साथ विश्लेषण किया जा करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए अच्छी अखंडता के साथ नमूना तैयारी की जरूरत है।
माउस ओएस कसकर आंख सॉकेट में एम्बेडेड था कि eyeball के साथ संबद्ध / वहाँ palpebral या bulbar कंजक्टिवा को नुकसान पहुँचाए बिना पूरे नेत्र सतह विच्छेदन के लिए जबरदस्त चुनौतियों का अस्तित्व है. इन चुनौतियों से उतर: (i) ओएस नरम और पतली है और शारीरिक रूप से अलग अभी तक चल पलकें और नेत्रगोलक, इसलिए विरूपण और क्षति के लिए कमजोर करने के लिए चिपका; और (पप) कक्षीय हड्डियों और नेत्रगोलक के बीच सीमित स्थान विच्छेदन प्रचालनों को प्रतिबंधित करता है। चुनौतियों वयस्क माउस के लिए बहुत अधिक हैं. भ्रूणीय माउस में कक्षीय अस्थि अस्थि-विज्ञान पूर्ण नहीं होता है तथा आस-पास के ऊतक सापेक्ष शिथिल8होते हैं। सिर को हटाया जा सकता है और bisected, और फिर सीधे paraformaldehyde (पीएफए) निर्धारण और embedding9के अधीन. इसके विपरीत, प्रसवके बाद और वयस्क माउस कक्षीय हड्डियों पूरी तरह से मोटी आसपास के ऊतकों के साथ ossified हैं, fixatives के प्रवेश कम कुशल बना. इसके अलावा, कक्षीय/स्कॉल हड्डियों कठिन और भंगुर होते हैं, आसानी से टूट जाते हैं जब उन्हें नरम embedding यौगिकों जैसे पैराफिन में sectioning. हड्डियों के टूटे हुए टुकड़े सर्वसम्मति से पास के ऊतकों को फाड़ देंगे जिसके परिणामस्वरूप ऊतक आकारिकी।
कई प्रकाशित अध्ययनों में प्राय : आंशिक नेत्र सतह दिखाई दी, जो उनके विशेष अनुसंधान प्रयोजनों के लिए पर्याप्त हो सकतीहै 10,11. साहित्य की घोर जांच में केवल कुछ ही अध्ययन ों को पाया गया जो विच्छेदन प्रोटोकॉल12,13के विस्तृत विवरण के बिना संपूर्ण अक्षुण्ण नेत्र सतह को दर्शाता है . इस प्रोटोकॉल में, हमने अभिन्न प्रसवोत्तर नेत्र सतह को प्राप्त करने के लिए एक विच्छेदन विधि का विस्तृत विवरण दिया है, जिसमें कक्षीय और खोपड़ी की हड्डियों को व्यवस्थित रूप से हटा दिया गया था, जिससे अनछुए नेत्र सतह को आंखों और पलकों के साथ छोड़ दिया गया था, जिससे शारीरिक क्षति को कम किया गया था। हम आगे ओएस ऊतक विज्ञान की जांच की और इस प्रोटोकॉल के साथ तैयार ऊतक वर्गों का उपयोग कर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रदर्शन किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
बरकरार नेत्रगोलक की तैयारी के लिए एक महत्वपूर्ण अनुस्मारक यह है कि सभी कक्षीय हड्डियों को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए, विशेष रूप से जुगा और अश्रु पूर्ण हड्डियों, जो छोटे हैं और आंख सॉकेट के नीचे के प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए प्रो Rong जू धन्यवाद, और तकनीकी सहायता के लिए सभी प्रयोगशाला के सदस्यों. यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी: 31571077) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; बीजिंग, चीन), गुआंग्झू शहर विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार परियोजना (201707020009; गुआंग्झू, गुआंग्डोंग प्रांत, चीन), “100 लोग योजना” सन यात-सेन विश्वविद्यालय (8300-18821104; गुआंग्झू, गुआंग्डोंग प्रांत, चीन), और झोंगशान नेत्र केंद्र में नेत्र विज्ञान के राज्य कुंजी प्रयोगशाला से अनुसंधान धन (303060202400339; गुआंग्झू, गुआंग्डोंग प्रांत, चीन).
Materials
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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