Isolering av intakt ögongloben för att få integrerad okulär ytvävnad för Histologisk undersökning och immunohistokemi
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för isolering av mus ögongloben med ögonlock, okulär yta, främre och bakre segment i relativt intakt läge.
Abstract
Okulär yta (OS) består av en epitelial ark med tre anslutna delar: palpebrala konjunktiva, bulbar konjunktiva och korneal epitel. Störningar av OS skulle leda till keratit, konjunktivit eller båda (keratokonjunktivit). I experimentella djurmodeller med vissa genetiska modifieringar eller konstgjorda operationer, är det lämpligt att undersöka alla delar av OS epitelial blad för att utvärdera relativa patogenetiska förändringar av varje del parallellt. Emellertid, dissektion av OS vävnad som helhet utan distorsion eller skada har varit utmanande, främst på grund av mjukhet och tunnhet av OS anbringas på fysiskt separata men rörliga ögonlock och ögongloben. Dessutom är den djupa ögon uttaget som bildas av den hårda skull/orbital ben fullt upptagen av ögongloben lämnar begränsat utrymme för att driva dissektioner. Som ett resultat, direkt dissektion av ögongloben med tillhörande OS vävnader från ansikts sidan skulle ofta leda till vävnadsskador, särskilt palpebrala och bulbar konjunktiva. I detta protokoll, vi beskrev en metod för att ta bort skalle och orbital ben sekventiellt från en bisekcted mus huvud, lämnar ögonlock, okulär yta, lins och näthinnan helt i ett stycke. Integriteten i OS-arket var väl bevarad och kunde undersökas med histologi eller immunofärgning i en enda sektion.
Introduction
Den okulära ytan består av en kontinuerlig ark av regionaliserade epitel inklusive palpebrala konjunktiva, bulbar konjunktiva och hornhinnan1. Många körtelstrukturer är förknippade med den okulära ytan epitel och tillsammans generera ett skikt av tår film skydda hornhinnan ytan från torkning och miljö invasioner2. Störningar av OS skulle leda till keratit, konjunktivit eller båda (keratokonjunktivit). Både genetiska faktorer och miljömässiga irriterande eller deras interaktioner bidra till patologiska förändringar av OS3,4. Följaktligen har en mängd genetiskt modifierade och fysiskt eller kemiskt inducerad djurmodeller använts för att studera sjukdomsprocesser i det mänskliga operativsystemet.
Den struktur och funktion av mus OS är liknande den hos människor på många sätt. Tår film komponenter utsöndras av okulära körtlar är också liknande mellan möss och människor. En mängd studier har utförts med hjälp av musmodeller för att belysa mekanismerna för mänskliga OS-sjukdomar5,6,7. I många fall är det viktigt att analysera globala i stället för lokala molekylära förändringar av operativsystemet för att få omfattande information under samma experimentella behandling. Därför behövs provberedning med god integritet för att säkerställa att varje del av operativsystemet analyseras samtidigt.
Musen OS tätt Associates med ögongloben som var inbäddad i ögat socket/omloppsbana (en benig kopp av flera olika skallben) och ansluter till den genom tunna bindväv. Det finns enorma utmaningar för dissekera hela ögats yta utan att skada palpebrala eller bulbar konjunktiva. Dessa utmaningar härstammar från: (i) OS är mjukt och tunt och anbringas på fysiskt åtskilda men rörliga ögonlock och ögongloben, därför sårbara för distorsion och skador; och (II) det begränsade utrymmet mellan orbital ben och ögongloben begränsa dissektion operationer. Utmaningarna är mycket större för den vuxna musen. I den embryonala musen, är orbital ben förbening inte fullständig och omgivande vävnader är relativa lös8. Huvudet kan avlägsnas och bisekeras, och sedan direkt utsätts för PARAFORMALDEHYD (PFA) fixering och inbäddning9. Däremot är de postnatal och vuxna mus orbital ben helt förbenad med tjocka omgivande vävnader, vilket gör penetrationen av fixeringsmedel mindre effektiva. Dessutom, orbital/skalle benen är hårda och sköra, lätt bryts när snittning dem i mjuk inbäddning föreningar såsom paraffin. Den brutna bitar av ben kommer enhälligt riva den närliggande vävnader resulterar i sämre vävnadmorfologi.
Många publicerade studier visade ofta partiell okulär yta, vilket kan vara tillräckligt för deras särskilda forskningsändamål10,11. En grov undersökning av litteraturer fann endast få studier som visar hela intakt okulär yta som demonstreras utan detaljerad beskrivning av dissektion protokoll12,13. I detta protokoll, vi detaljerade en dissektion metod för att få integrerad postnatal okulär yta, där orbital och skallben var ordnad bort, lämnar orörd okulär yta tillsammans med ögongloben och ögonlocken, minimera de fysiska skadorna. Vi undersökte vidare OS-histologin och utförde immunohistokemi med hjälp av de vävnads sektioner som utarbetats med detta protokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kritisk påminnelse för beredning av intakt ögongloben är att alla orbital ben måste avlägsnas helt, särskilt Juga och lacrimal ben, som är små och ligger nära botten av ögat socket. Eventuella överfall ben kan komplicera den efterföljande histologin. Om en liten bit av ben inte var helt bort från dissektion av misstag, kan det plockas ut från inbäddning paraffin blocket med ett par sharptweezers. Hålet som lämnas kvar ska fyllas med smält paraffin efter denna operation.
Y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar prof. Rong ju för kritisk läsning av manuskriptet, och alla Lab medlemmar för teknisk assistans. Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (NSFC: 31571077; Peking, Kina), Guangzhou City Sciences och teknik innovation Project (201707020009; Guangzhou, Guangdongprovinsen, Kina), “100 People plan” från Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, Guangdongprovinsen, Kina), och forskningsfinansiering från State Key Laboratory oftalmologi vid Zhongshan ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, Guangdongprovinsen, Kina).
Materials
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
- Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
- Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
- Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
- Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
- Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
- Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
- Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
- Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
- Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
- McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
