En høj-throughput In Situ metode til vurdering af Hepatocyt Nuklearploidy i mus
Summary
Vi præsenterer en robust, omkostningseffektiv og fleksibel metode til måling af ændringer i hepatocytnummer og nukleart trick i faste/kryoreserverede vævsprøver, der ikke kræver flowcytometri. Vores tilgang giver en kraftfuld prøve-dækkende underskrift af levercytologi ideel til sporing af udviklingen af leverskader og sygdom.
Abstract
Når leveren er skadet, hepatocyt numre falde, mens cellestørrelse, nuklear størrelse og ploidy stigning. Udvidelsen af ikke-parenkymale celler såsom cholangiocytter, myofibroblaster, sformidler og inflammatoriske celler indikerer også kroniske leverskader, vævsremodellering og sygdomsprogression. I denne protokol, Vi beskriver en simpel høj-throughput tilgang til beregning af ændringer i den cellulære sammensætning af leveren, der er forbundet med skade, kronisk sygdom og kræft. Vi viser, hvordan oplysninger udvundet fra to-dimensionelle (2D) væv sektioner kan bruges til at kvantificere og kalibrere hepatocyt nukleare ploidy i en prøve og gøre det muligt for brugeren at finde specifikke ploidy delmængder i leveren in situ. Vores metode kræver adgang til fast / frosset levermateriale, grundlæggende immuncytokemi reagenser og enhver standard højt indhold imaging platform. Det fungerer som et effektivt alternativ til standard flow cytometri teknikker, som kræver afbrydelse af frisk indsamlet væv, tab af rumlig information og potentielle disaggregering bias.
Introduction
Hepatocytter i pattedyrleveren kan gennemgå blokeret cytokinese til fremstilling af binukleare celler og DNA-endoreplication til fremstilling af polyploidkerner, der indeholder op til 16N DNA-indhold. Samlet cellulære og nukleare trick stigning under postnatal udvikling, aldring og som reaktion på forskellige cellulære belastninger1. Polyploidiseringsprocessen er dynamisk og reversibel2, selv om dens præcise biologiske funktion fortsat er uklar3. Øget ploidy er forbundet med nedsat spredningskapacitet4, genetisk mangfoldighed2, tilpasning til kronisk skade5 og kræftbeskyttelse6. Hepatocyte ploidy ændringer opstår som følge af ændret døgnrytme7, og fravænning8. Mest bemærkelsesværdigt, den ploidy profil af leveren er ændret ved skade og sygdom9, og overbevisende beviser tyder på, at specifikke kneb ændringer, såsom øget ≥8N kerner eller tab af 2N hepatocytter, give nyttige underskrifter til sporing af ikke-alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD) progression3,10, eller den differentierede virkning af virusinfektioner11.
Generelt er leverskader og regenerering forbundet med øget hepatocytcellestørrelse og nukleart område12, sammen med et reduceret samlet antal hepatocytter, især dem med 2N-DNA-indhold10,11. Parenkymal skade i leveren er også ofte ledsaget af udvidelse af ikke-parenkymale celler (NPC’ere), herunder stromale myofibroblaster, inflammatoriske celler og bipotente leverstamceller. Metoder med høj overførselsmængde, der giver en kvantitativ cytologisk profil af parenkymale celletal og nukleart kneb, samtidig med at der er taget højde for ændringer i NPC’er, har derfor et betydeligt potentiale som forskning og kliniske værktøjer til at spore leverens respons under skade og sygdom. Overbevisende seneste in situ analyse af ploidy spektre i humane prøver af hepatocellulært karcinom viser også, at nukleart trick er dramatisk øget inden for tumorer og er specifikt forstærket i mere aggressive tumor undertyper med reduceret differentiering og tab af TP5313. Derfor er der en stærk mulighed for, at metodiske fremskridt i kvantitativ vurdering af nukleart arbejde vil hjælpe med fremtidige prognostiske profilering af leverkræft.
I denne protokol beskrives en fleksibel metode med høj gennemløb til sammenlignende analyse af sektioner af muselevervæv, som giver detaljeret cytometrisk profilering af hepatocytnumre, NPC-respons og en internt kalibreret metode til vurdering af nukleart ploidy (figur 1). Hepatocytter adskiller sig fra NPC’ere ved hepatocyt nuklear faktor 4 alpha (HNF4α) immunmærkning, før karakterisering af nuklear størrelse og nuklear morfometri. “Minimalt DNA-indhold” estimeres for alle cirkulære nukleare masker ved at integrere middelværdien Hoechst 33342 intensitet (en proxy for DNA-tæthed) med interpoleret tredimensionel (3D) nuklear volumen. Hepatocyt minimal DNA-indhold kalibreres derefter ved hjælp af NPC’ere til at generere en nuklear ploidy profil.
Billederhvervelse, nuklear segmentering og billedanalyse udføres ved hjælp af billedbehandling med højt indhold, hvilket gør det muligt at screene store områder med todimensionale (2D) leversektioner, der indeholder titusindvis af celler. En skræddersyet program er fastsat for automatiseret efterbehandling af højt indhold billedanalyse data til at producere en prøve-dækkende ploidy profil for alle cirkulære hepatocyt kerner. Dette udføres ved hjælp af gratis at downloade software til at beregne nukleare kneb baseret på stereologisk billedanalyse (SIA)10,11,14,15. SIA-metoden er tidligere blevet valideret af flowcytometri som en nøjagtig, om end besværlig, metode til vurdering af hepatocyt nukleart trick i leveren14, under forudsætning af cirkulær nuklear morfologi og en monoton sammenhæng mellem nuklear størrelse og DNA-indhold. I denne protokol måles begge nukleare parametre ved vurdering af nuklear morfometri og Hoechst 33342-mærkning. Beregning af “minimalt DNA-indhold” for hver atommaske efterfølges af kalibrering af hepatocytnukleart ploidy ved hjælp af NPC’ere, som har et kendt 2−4N DNA-indhold og derfor tjener som en nyttig intern kontrol.
Sammenlignet med konventionelle flow cytometri metoder16 den beskrevne fremgangsmåde gør det muligt hepatocyt nukleare ploidy, der skal vurderes in situ og kræver ikke adgang til frisk væv eller disaggregation metoder, der kan bias resultater og være vanskeligt at standardisere. Som med alle SIA-baserede tilgange er kerneploidi-underklasserne >2N underrepræsenteret ved 2D-prøvetagning på grund af skæring af større kerner uden for ækvatorialplanet. Den vævsdækkende ploidy-profil beskriver også minimums-DNA-indholdet for alle cirkulære hepatocytnukleare masker og diskriminerer ikke direkte mellem mononukleare hepatocytter og binukleare celler, der har to diskrete (“ikke-rørende”) kerner af samme ploidi. Denne protokols enkelhed giver imidlertid mulighed for at tilpasse den til yderligere parametre såsom internuklear afstand eller celleperimeteranalyse, som vil gøre det lettere at identificere tonukleare celler, hvilket giver en mere detaljeret vurdering af celleploidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
En tilgang med højt indhold og høj gennemløb til analyse af vævsremodellering og estimering af hepatocytnukleart ploidi i murineleveren er beskrevet. Når en bruger er fortrolig med proceduren, kan han behandle, afhøre og analysere flere prøver inden for en periode på 3-5 dage og generere store testbare datasæt, der giver en detaljeret underskrift af leverens tilstand. I betragtning af enkeltheden i prøvepræparatmetoden er resultaterne sammen med det store antal celler og vævsområdet analyseret (i gennemsnit …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af den spanske MINECO regering tilskud BFU2014-58686-P (LAN) og SAF-2017-84708-R (DJB). LAN blev støttet af en national MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 og Plan GenT-pris (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) og FMN af et regionalt ValI+D studenterkontor ved Valencias Generalitat ACIF/2016/020. RP vil gerne anerkende prof. Ewa K. Paluch for finansiering. Vi takker Dr. Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometri service) for hjælp med IN Cell Analyzer platform.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
References
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?. Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
- Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
- Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
- Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
- Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
- Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
- Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
- Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
- Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
- Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
- Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
- Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy – I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
- Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
- Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
- Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
- Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
- Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
- Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
- Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
- Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).
