Um método de alta produtividade in situ para estimação da ploidiii y nuclear hepatocida em camundongos

Summary

Apresentamos um método robusto, econômico e flexível para medir mudanças no número de hepatócitos e ploidy nuclear em amostras de tecido fixo/criopreservado que não requerem citometria de fluxo. Nossa abordagem fornece uma poderosa assinatura amostral de citologia hepática ideal para rastrear a progressão de lesões hepáticas e doenças.

Abstract

Quando o fígado está ferido, os números de hepatócitos diminuem, enquanto o tamanho da célula, o tamanho nuclear e a ploidy aumentam. A expansão de células não parenquiais como colangiocytes, miofibroblastos, progenitores e células inflamatórias também indicam danos crônicos no fígado, remodelação tecidual e progressão da doença. Neste protocolo, descrevemos uma abordagem simples de alto throughput para calcular mudanças na composição celular do fígado que estão associadas a lesões, doenças crônicas e câncer. Mostramos como as informações extraídas de seções de tecido bidimensional (2D) podem ser usadas para quantificar e calibrar ploidy nuclear hepatocito dentro de uma amostra e permitir que o usuário localize subconjuntos específicos de ploidy dentro do fígado in situ. Nosso método requer acesso a material hepático fixo/congelado, reagentes básicos de imunocitoquímica e qualquer plataforma de imagem padrão de alto conteúdo. Ele serve como uma poderosa alternativa às técnicas padrão de citometria de fluxo, que requerem interrupção do tecido recém-coletado, perda de informações espaciais e viés de desagregação potencial.

Introduction

Hepatócitos no fígado de mamíferos podem sofrer citocinese paralisada para produzir células binucleares, e endoreplicação de DNA para produzir núcleos poliplóides contendo até 16N conteúdo de DNA. Aumento geral da ploididy celular e nuclear durante o desenvolvimento pós-natal, envelhecimento e em resposta a diversos estresses celulares¹. O processo de poliploidização é dinâmico e reversível^2,embora sua função biológica precisa ainda não esteja clara³. O aumento da ploidia está associado à redução da capacidade proliferativa⁴, diversidade genética², adaptação à lesão crônica⁵ e proteção contra o câncer⁶. Alterações de ploidy hepatocito ocorrem como resultado de um ritmo circadiano alterado⁷, e desmame⁸. Mais notavelmente, o perfil ploidiano do fígado é alterado por lesão e doença⁹, e evidências convincentes sugerem que alterações específicas de ploidia, como o aumento de núcleos ≥8N ou perda de hepatócitos 2N, fornecem assinaturas úteis para o rastreamento da progressão da doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD)^3,10, ou o impacto diferencial das infecções virais¹¹.

Em termos gerais, a lesão hepática e a regeneração estão associadas ao aumento do tamanho das células hepatocitos e da área nuclear^12,juntamente com o número global reduzido de hepatócitos, particularmente aqueles com teor de DNA 2N^10,11. A lesão parenquimal no fígado também é frequentemente acompanhada pela expansão de células não parenquiais (NPCs), incluindo miofibroblastos estrômicos, células inflamatórias e células progenitoras hepáticas bipotentes. Métodos de alto throughput que fornecem um perfil citológico quantitativo de número de células parênquias e ploidia nuclear, ao mesmo tempo em que contabilizam mudanças nos NPCs, portanto, têm um potencial considerável como pesquisas e ferramentas clínicas para acompanhar a resposta do fígado durante lesões e doenças. Análises recentes convincentes in situ de espectroplóide em amostras humanas de carcinoma hepatocelular também demonstram que a ploidia nuclear é dramaticamente aumentada dentro dos tumores e é especificamente amplificada em subtipos tumorais mais agressivos com diferenciação reduzida e perda de TP53¹³. Assim, há uma forte possibilidade de que os avanços metodológicos na avaliação quantitativa da ploididia nuclear ajudem no futuro perfil prognóstico do câncer de fígado.

Neste protocolo, descreve-se uma metodologia flexível de alto desempenho para a análise comparativa das seções de tecido hepático do camundongo, que fornece perfis citométricos detalhados de números de hepatócitos, a resposta do NPC e um método previamente calibrado internamente para estimar ploidy nuclear (Figura 1). Os hepatócitos são distinguidos dos NPCs pela imunorotulagem do fator nuclear 4 alfa (HNF4α), antes da caracterização do tamanho nuclear e da morfometria nuclear. “Conteúdo mínimo de DNA” é estimado para todas as máscaras nucleares circulares, integrando a intensidade média de Hoechst 33342 (um proxy para a densidade de DNA) com volume nuclear tridimensional interpolado (3D). O conteúdo mínimo de DNA do hepatócito é então calibrado usando NPCs para gerar um perfil de ploidia nuclear.

Aquisição de imagens, segmentação nuclear e análise de imagens são realizadas por meio de imagens de alto conteúdo, permitindo que grandes áreas de seções hepáticas bidimensionais (2D) contendo dezenas de milhares de células sejam rastreadas. Um programa personalizado é fornecido para o pós-processamento automatizado de dados de análise de imagens de alto conteúdo para produzir um perfil ploidy em toda a amostra para todos os núcleos de hepatócitocircularcircular. Isto é realizado usando software gratuito para baixar software para calcular ploidia nuclear com base na análise de imagem estereológica (SIA)^10,11,14,15. A metodologia SIA foi previamente validada pela citometria de fluxo como um método preciso, embora trabalhoso, para estimar ploidiy nuclear hepatocito no fígado¹⁴, assumindo morfologia nuclear circular e uma relação monótônica entre tamanho nuclear e conteúdo de DNA. Neste protocolo, ambos os parâmetros nucleares são medidos pela avaliação da mormetria nuclear e da rotulagem Hoechst 33342. O cálculo do “conteúdo mínimo de DNA” para cada máscara nuclear é seguido pela calibração da ploidia nuclear hepatocito usando NPCs, que têm um conteúdo conhecido de DNA 2-4N e, portanto, servem como um controle interno útil.

Em comparação com os métodos convencionais de citometria de fluxo^16, a abordagem descrita permite que a ploidiiiiiide nuclear hepatocida seja avaliada in situ e não requer acesso a métodos de tecido fresco ou desagregação que podem influenciar os resultados e ser difíceis de padronizar. Como em todas as abordagens baseadas no SIA, as subclasses ploidiais nucleares >2N são sub-representadas pela amostragem 2D devido à secção de núcleos maiores fora do plano equatorial. O perfil ploidy em todo o tecido também descreve o conteúdo mínimo de DNA para todas as máscaras nucleares hepatocidas circulares, e não discrimina diretamente entre hepatocitos mononucleares e células binucleares que têm dois núcleos discretos (“não tocantes”) da mesma ploidy. No entanto, a simplicidade deste protocolo permite um espaço considerável para que ele seja adaptado para responder por parâmetros adicionais, como espaçamento internuclear ou análise de perímetro celular, o que facilitaria a identificação de células binucleares, proporcionando uma avaliação mais detalhada da ploidiia celular.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram previamente aprovados pelo comitê de ética do CIPF. Os camundongos foram alojados em uma instalação sem patógenos no Centro de Investigação Príncipe Felipe (Valência, Espanha), registrado como um criador de animais experimental, usuário e centro de abastecimento (reg. no. ES 46 250 0001 002) nos regulamentos de bem-estar animal europeus e espanhóis vigentes (RD 53/2013). 1. Colheita de tecidos e preparação da amostra <p class="jove_content…

Representative Results

Este método tem sido utilizado para medir o impacto da lesão colestática no fígado de camundongos adultos, alimentando animais por 0-21 dias com uma dieta hepatotóxica contendo 0,1% 3,5-dietoxicarbonilo-1,4-dihidrocollidina (DDC)17. A alimentação crônica de DDC resulta em lesão hepatocelular aumento da ploidia e expansão periportal de NPCs. O usuário deve estar ciente de que a tensão do camundongo e as diferenças dependentes da idade podem existir na p…

Discussion

Uma abordagem de alto teor e alto throughput para a análise da remodelagem de tecidos e estimativa da ploidiiiiiie nuclear hepatocito no fígado de murina é descrita. Uma vez familiarizado com o procedimento, o usuário pode processar, imagem e analisar várias amostras em um período de 3 a 5 dias, gerando grandes conjuntos de dados técíveis que fornecem uma assinatura detalhada da saúde hepática. Dada a simplicidade do método de preparação da amostra, juntamente com o grande número de células e área tecidua…

Materials

3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)	TestDiet	1810704	Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)	Invitrogen	A11055	Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cryostat Leica CM1850 UV	Leica biosystems	CM1850 UV	Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium	Dako	S3023
GraphPad Prism	GraphPad Software	Prism 8	Statistical software for graphing data
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000	GE Healthcare Bio-Sciences Corp		High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB	MathWorks	R2019a	Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides	VWR International	630-2864	Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel	Microsoft		Speadsheet software
OCT Tissue Tek	Pascual y Furió	4583
Paraformaldehyde	Panreac AppliChem	141451.121
Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	5mm tip width
Polysine Microscope Slides	VWR International	631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α	Thermo Fisher Scientific	PA5-79380	Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α	Santa Cruz Biotechnology	sc-6556	Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P5927