En mångsidig kryoslicing BN-MS protokoll med hjälp av en mikrotom presenteras för högupplöst complexome profilering.
Proteiner utövar i allmänhet biologiska funktioner genom interaktioner med andra proteiner, antingen i dynamiska protein sammansättningar eller som en del av stabilt bildade komplex. Den senare kan vara elegant lösas enligt molekylstorlek med hjälp av infödda polyakrylamid gel elektrofores (BN-sida). Koppling av sådana separationer till känslig masspektrometri (BN-MS) har varit väletablerad och teoretiskt möjliggör en uttömmande bedömning av extraherbara complexome i biologiska prover. Men, detta tillvägagångssätt är ganska mödosam och ger begränsad komplex storlek upplösning och känslighet. Också, dess tillämpning har förblivit begränsad till rikliga mitokondriella och plastida proteiner. För en majoritet av proteiner saknas det således fortfarande information om integration i stabila proteinkomplex. Presenteras här är en optimerad metod för complexome profilering består Preparative-skala BN-sida separation, sub-millimeter provtagning av breda gel körfält genom cryomicrotome skivning, och masspektrometriska analys med etikett-fri protein kvantifiering. Procedurerna och verktygen för kritiska steg beskrivs i detalj. Som ett program, beskriver rapporten complexome analys av en solubilized endosome-berikad membran fraktion från mus njurar, med 2 545 proteiner profilerade totalt. Resultaten visar identifiering av enhetliga, låg-överflöd membranproteiner såsom intracellulära jonkanaler samt hög upplösning, komplexa protein monteringsmönster, inklusive glykosylering isoformer. Resultaten är i samförstånd med oberoende biokemiska analyser. Sammanfattningsvis möjliggör denna metod för omfattande och opartisk identifiering av protein (Super) komplex och deras subenhet sammansättning, vilket ger en grund för att undersöka stökiometri, montering och interaktion dynamik av proteinkomplex i någon biologiska systemet.
BN-PAGE separation var först direkt kopplad till LC-MS analys (BN-MS) av Majeran1 och Wessels2 forskargrupper med manuell skärning av BN-sida gel körfält. Deras analyser identifierade ett antal rikliga membranprotein komplex med känd subenhet sammansättning från växt plastids och HEK cell mitokona, respektive. Dessa analyser var dock långt ifrån heltäckande och tillät inte en opartisk identifiering av nya sammansättningar. Prestanda för masspektrometrar och märknings fria kvantifieringsmetoder har förbättrats avsevärt sedan dess, vilket har möjliggjort omfattande BN-MS-analyser. Detta har myntat termen “complexome profilering”. Till exempel, Heide och medarbetare analyserade råtta hjärtat mitokondrien identifiera och klustring 464 mitokondriell proteiner, vilket bekräftar många kända sammansättningar. Dessutom fann de TMEM126B vara en roman och avgörande subenhet av en specifik församling komplex3. Jämförbara resultat (med 437 mitokondriella protein profiler) erhölls i en parallell studie av HEK-cellmitochondria4.
Trots dessa förbättringar har flera frågor förblivit att begränsa den fulla potentialen av BN-MS för complexome profilering. En stor begränsning är en effektiv storleks matchning av komplex som bestäms av två faktorer: (i) kvaliteten på BN-sidan separation, som beror på enhetlighet i gelmatrisen pore lutning samt stabilitet/löslighet av provet komplex, och (II) steg storlek på gel sampling, som är i bästa fall 1 mm vid användning av konventionella manuella skivning5,6. Dålig storlek upplösning inte bara missar subtila komplexa isoformer och heterolikteter, men det också negativt påverkar det dynamiska omfånget och förtroendet för opartisk, de Novo subenhet tilldelning och kvantifiering.
Andra utmaningar är precisionen för proteinkvantifiering och täckningen av det faktiska dynamiska omfånget av protein överflöd i provet genom masspektrometriska analyser. Därför har tillämpningen av BN-MS complexome-profilering i stort sett begränsats till biologiska prover med lägre komplexitet, högt uttryck för målkomplex och gynnsamma solubiliseringsegenskaper (dvs. plastider, mitokon mikroorganismer)6,7,8,9,10.
Vi introducerade nyligen cryomicrotome skivning-Assisted BN-MS (csBN-MS), som kombinerar exakt sub-millimeter provtagning av BN-sida gel körfält med omfattande MS-analys och utarbeta MS databehandling för bestämning av protein profiler med hög förtroende11. Ansökan till en mitokondriell membran beredning från råtta hjärnor visat tidigare otillfredsställda effektiv komplex storlek upplösning och maximal täckning av oxidativ respiratorisk kedja komplexa (oxfos) subenheter (dvs., 90 av 90 MS-tillgänglig). I detta exempel identifierades också ett antal nya protein sammansättningar.
Beskrivs här är optimerade procedurer för förberedande skala BN-sida separation av proteinkomplex (inte begränsat till en viss biologisk källa), gjutning av stora förberedande BN-sida geler, cryomicrotome skivning av breda gel körfält, och MS data Bearbetning. Prestanda för högupplöst profilering demonstreras för ett proteinkomplex beredning från mus njure endosome-berikade membran. Slutligen diskuteras fördelarna med ökad upplösning och precision i masspektrometriska kvantifieringen.
Den presenterade studien bygger på csBN-MS teknik som tidigare riktats med en mitokondriell förberedelse11 och införlivas förbättringar i provberedning, gel bearbetning, och MS datautvärdering. Fokuserad analys av en del av den storskaliga separation BN-PAGE gel som en omfattande uppsättning data som visar kvalitetsmått jämförbara med studien med mitokondriella membran. Mass-och retentionstid fel samt Run-to-run variationer hölls mycket låg och som grund för att fastställa tillförlitliga protein överflöd profiler. Storleks upplösningen verkade vara bra, med halva maximala topp bredder så låga som sex skivor (motsvarande 1,5 mm, figur 4) och relativa storleksskillnader på mindre än 10% lösta (figur 3, figur 5A). Dessa värden uppfyllde inte helt kvalitets upplösningen för den tidigare csBN-MS-analysen av mitokona (trots den mindre stegstorleken för gel provtagning), men de är betydligt bättre än prestandan hos konventionella BN-MS-eller storleks uteslutnings MS närmar sig20 som nyligen har blivit populära.
Vikten av en hög effektiv komplex storlek upplösning är understryks av simulerings experiment i figur 3 (med hjälp av TPC1-associerade komplex) som knappast kan lösas genom 2D BN/SDS-Page Western blot-analys (figur 1B). Dessa resultat tyder på att 0,25 mm-skivning i detta fall resulterade i en del översampling, men det visade sig ändå vara användbart för eliminering av “kvantifieringsbrus” utan att kompromissa med effektiv storleks upplösning. Således, i linje med tidigare resultat11, en provtagning steg storlek på ~ 0,3 mm är i allmänhet rekommendabelt.
Särskilt, diskriminering av TPC1-associerade komplex är helt förlorad med 1 mm gel provtagning, som är den minsta steg storlek som tillhandahålls av manuell skivning i konventionella BN-MS5,6. Detta kan förklara det faktum att trots kraftfulla MS-teknik finns, mycket få proteinkomplex och subenheter har identifierats de Novo av complexome profilering. Förutom sin goda förmåga att lösa, erbjuder csBN-MS hög mångsidighet. Membranbundna komplex och lösliga proteinkomplex som sträcker sig från 50 kDa till flera MDa kan lösas effektivt i ett enda experiment med minsta bias11. Detta kontrasterar mot alternativa separations tekniker som används för complexome-profilering som storleks uteslutning eller jonbyteskromatografi, som fungerar med undergrupper av lösliga proteiner med vissa storleksintervall eller laddningsegenskaper. På nedåtsidan, csBN-MS är mindre skalbar (maximal belastning på ~ 3 mg protein per gel), kan vara tekniskt utmanande, och kan inte automatiseras.
Sammantaget visar resultaten att csBN-MS-baserad complexome-profilering framgångsrikt kan tillämpas på icke-mitokondriella mål, utan även på vissa associerade utmaningar. Sålunda, effektiv utvinning och biokemisk stabilitet av proteinkomplex kräver mer optimering, och rengöring steg och kan fortfarande vara begränsad. Inom den undersökta storleks fönster, antalet välfokuserade, monodisperse proteinkomplex var verkligen betydligt lägre (data som inte visas) jämfört med ett mitokondriellt prov. Det rekommenderas också att sänka BN-sidan prov laster för att få acceptabel gel separation. Högre laster kan kräva bredare gel banor som är svårare att bearbeta ordentligt för skivning (Se medföljande video). Dessutom var protein komplexiteten hos proverna högre (ungefär två gånger) än de mitokonshärledda segmentets sammandrag, vilket ledde till mer saknade PV-värden och ett reducerat dynamiskt omfång. Faktum är att vissa små proteiner som förväntas vara en del av komplexen som visas i figur 5 saknades i analyserna. Dessa problem kan lösas i framtiden genom att använda snabbare och känsligare MS-instrument eller data oberoende förvärvsmetoder.
Provberedning är mycket kritisk för proteinkomplex hämtning, stabilitet, och gel separation kvalitet. Parametrar och procedurer bör optimeras för varje källa vävnad, cell lysate, membran (fraktion), och proteinkomplex av intresse. Följande allmänna rekommendationer kan hjälpa till att förlänga ansökningarna från csBN-MS:
i förbereda prover som är färska och undvika uppvärmning/frysning, kraftiga utspädningar, förändringar i buffertförhållanden och onödiga förseningar,
II) användning av buffertar som i huvudsak saknar salter (Ersätt med 500-750 mm betain eller aminokapronsyra), om ett neutralt pH, och som innehåller upp till 1% (w/v) icke-denaturerande rengöringsmedel (protein: förhållandet mellan tvättmedel och 1:4-1:10 för att lösgöra membran proteinkomplex, inget tvättmedel krävs för lösliga proteinkomplex).
III) noggrann testning och justering av tvättmedels förhållandena genom analytisk BN-sida, eftersom dessa kan påverka effektiviteten av komplicerad solubilisering, representation av membranprotein komplex i provet, stabilitet och homogenitet hos miceller för protein tvättmedel. De senare är förutsättningar för proteiner att fokusera som distinkta band/komplexa populationer på BN-sida geler. Tidigare litteratur erbjuder ett brett sortiment av neutrala rengöringsmedel. Emellertid, DDM (n-dodecyl β-d-maltoside)1,2,4,5,6 och digitonin3,5,7,8, 9,10,13,18 har varit de mest populära valen för BN-MS analyser hittills. Det måste understrykas att alla tvättmedel villkor nödvändigtvis utgör en kompromiss mellan solubilisering effektivitet och bevarande av protein interaktioner och kanske inte lika lämpade för alla typer av målprotein och källmaterial;
(IV) ta bort laddade polymerer som fibriller, glödtrådar, polylysin, DNA, och riklig lägre molekylvikt komponenter (dvs, metaboliter, lipider, eller peptider). Detta kan åstadkommas genom ultracentrifugation, gelfiltrering, eller dialys. Detta är särskilt viktigt för totala cell-eller vävnads lysater;
v) tillsats av Coomassie G-250 (slutlig koncentration 0,05%-0,1%) och sackaros (för att öka densiteten för lastning, slutlig koncentration 10%-20% [w/v]) till provet strax före lastning, för att klara av kort ultracentrifugation, Ladda provet utan störning, och starta körningen omedelbart därefter.
Som ett framtidsperspektiv erbjuder csBN-MS-baserade complexome-profilering alternativ för multiplexering för att studera proteinkomplex dynamik eller förändringar relaterade till specifika biologiska förhållanden. Kombinerad separation av metaboliskt märkta prover som föreslagits för storleks uteslutnings baserad profilering21 förefaller okomplicerad, men den kan hämmas av spontan subenhet utbyte i komplex som förekommer oberoende av den använda separation Metod. Alternativt kan märkta prover lösas i angränsande gel körfält, som sedan kan samskivade eller kombinerade efter smälta för differential analys med hög känslighet och robusthet.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tyska Research Foundation)-projekt-ID 403222702-SFB 1381 och enligt Tysklands Excellence strategi CIBSS-EXC-2189-projekt-ID 390939984. Vi tackar Katja Zappe för teknisk assistans.
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio Rad | #1610158 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13% |
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio Rad | #1610154 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13% |
SYPRO Ruby Protein Blot Stain | Bio Rad | #1703127 | Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection |
Coomassie Brilliant Blue G-250 | Serva | no. 35050 | Centrifugate stock solutions prior to use |
ComplexioLyte 47 | Logopharm | CL-47-01 | Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins |
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium | Leica Biosystems | 14020108926 | Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome |
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm | Merck | IPVH00010 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml | n.a. | n.a. | any supplier, important for making gel section embedding tool |
broad razor blade | n.a. | n.a. | any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes |
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long | n.a. | n.a. | mold for embedding and freezing of gel samples |
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | Nr. 0030108116 | highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption |
sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm | Dionex / Thermo Scientific | P/N 160454 | |
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) | New Objective | FS360-75-8 | |
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) | Dr. Maisch GmbH | r13.93. | columns packed manually |
rabbit anti-TPC1 antibody | Gramsch Laboratories | custom production | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | CY-1300 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated | Vector Laboratories | #B1325 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
cryo-microtome Leica CM1950 | Leica Biosystems | 14047743905 | |
Mini Protean II Cell with wetblot unit | Bio Rad | n.a. | for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more) |
Penguin Midi Gel Electrophoresis System | PeqLab | n.a. | for BN-PAGE (not sold any more) |
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera | Zeiss / Photometrics | n.a. | |
peristaltic pump (IP high precision multichannel) | Ismatec | ISM940 | for casting of gradient polyacrylamide gels |
gradient mixer with stirring (two chambers) | selfmade, alternatively Bio Rad | 1652000 or 1652001 | for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf) |
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor | Sorvall / Thermo Scientific | n.a. | for sample preparation (not sold any more) |
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC | Dionex / Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMAZQ |